Виды и функции протеаз внеклеточного матрикса

Добавил пользователь Skiper
Обновлено: 14.12.2024

Моделирование патологических процессов на клетках является важным этапом изучения механизмов, приводящим к тем или иным нарушениям в соединительной ткани, где внеклеточный матрикс и лизосомальные протеазы играют существенную роль в межклеточных взаимодействиях. Использование катепсинов в исследованиях на клетках in vitro, продуцирующих большое количество внеклеточного матрикса, представляется перспективным для моделирования некоторых звеньев патологических процессов, происходящих в хрящевой и костной тканях. Сравнительное исследование активности этих ферментов в разных органах животных - необходимый этап в выборе источника выделения данных ферментов. Показано, что наибольшая активность катепсина B выявляется в селезенке крыс, а катепсинов L, S и D - в почке, поэтому при использовании более чем 2-х крыс, источником для выделения соответствующих ферментов могут быть селезенка и почка. Наименьшая активность всех исследуемых цистеиновых протеаз выявлена в печени и составляет 10-30 % активности от наибольшей активности, выявляемых в почке или селезенке. При использовании одного животного печень крыс из-за существенно большей массы по сравнению с другими органами больше подходит для экстракции ферментов, чем селезенка и почка.

1. Венедиктова А.А. Роль протеаз различных классов в развитии остеопороза у крыс: автореф. дис. … канд. биол. наук. - Новосибирск, 2009. - 24 с.

2. Изменение активности катепсинов В, L и D в печени у крыс Wistar и преждевременно стареющих крыс OXYS разного возраста /А.А. Венедиктова, О.В. Фаламеева, Н.Г. Колосова и др. // Сибирский научный медицинский журнал. - 2007. - Т. 27, № 3. - С. 127-132.

4. Фаламеева О.В. Роль протеиназ лизосом и их эндогенных ингибиторов при росте и химиотерапии опухолей у мышей: автореф. дис. … канд. мед. наук. - Новосибирск, 2002. - 28 с.

5. Cartilage macromolecules and the calcification of cartilage Matrix / A.R. Poole, Y. Matsui, A. Hinek, E.R. Lee // The anatomical record. - 1989. - Vol. 224. - P. 167-179.

6. Degradation of the endothelial glycocalyx in clinical settings: searching for the sheddases / B.F. Becker, M. Jacob, S. Leipert et al. // Br. J.Clin. Pharmacol. - 2015. - Vol. 80(3). - P. 389-402.

8. Distribution of basement membrane molecules, laminin and collagen Type IV, in normal and degenerated cartilage tissue / C. Bindzus, W.S. Toh, A.H. Gomoll et al. // Cartilage. - 2014. - Vol. 5(2). - P. 123-132.

9. Distribution of cathepsins B and H in rat tissues and peripheral blood cells /E. Kominami, T.Tsukahara, Y.Bando, N. Katunuma // J. Biochem. - 1985. - Vol. 98 (1). - P. 87-93.

11. Novinec M., Lenari B., Turk B. Cysteine Cathepsin Activity Regulation by glycosaminoglycans // BioMed. Research International. - 2014. - 9 p.

12. Olbricht C.J. Distribution of cathepsins B and L in the kidney and their role in tubular protein absorption // Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. - 1992. - Vol. 30 (10). - P. 675-81.

13. Secreted cathepsin L generates endostatin from collagen XVIII / U. Felbor, L. Dreier, R.A.R. Bryant et al. // EMBO J. - 2000. - Vol. 19(6). - P. 1187-1194.

14. Specific catalytic activity of cathepsin S in comparison to cathepsins B and L along the rat nephron / Н. Schmid, M. Koop, S. Utermannet al. // Biol Chem. - 1997. - Vol. 378 (2). - P. 61-69.

15. Splenic cathepsin L is maturated from the proform by interferon-gamma after immunization with exogenous antigens / T. Zhang, Y. Maekawa, T. Sakai et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2001. - Vol. 283 (2). - P. 499-506.

Моделирование патологических процессов in vitro, происходящих при повреждении хрящевой и костной тканей, является важным этапом в выявлении и понимании патогенетических механизмов заболеваний, приводящих к формированию костных и хрящевых дефектов. Внеклеточный матрикс кости и хряща играет значительную роль в функционировании резидентных клеток. Установлено, что его компоненты влияют на клетки как прямо, так и опосредовано. Так, молекулы проколлагена II типа, синтезируемые клетками первичного регенерата в месте дефекта костной ткани, являются центрами кристаллизации, поскольку адсорбируют кальций на своих пропептидах, а также инициируют прорастание сосудов в зону дефекта, способствуя замещению первичного регенерата костным [5]. Не исключено, что отщепление пропептидов коллагена протеазами и элиминация их из матрикса может изменять скорость ангиогенеза и кальцификации в регенерате.

Протеогликаны (ПГ) в силу своих физико-химических свойств способны адсорбировать факторы роста, регулируя биосинтетическую или митотическую активность клеток [3], поэтому их производные, полученные в ходе ограниченного протеолиза, могут изменять их функциональные свойства. Существенному усилению скорости деградации белков катепсинами B, L и S способствуют гликозаминогликаны (ГАГ), которые наряду с коллагеном в составе ПГ составляют основу матрикса хряща и которые высвобождаются после расщепления белкового компонента ПГ протеазами в матриксе [11]. Было установлено, что при связывании с такими ГАГ, как гепарин, дерматансульфат, хондроитинсульфат С и гиалуронан, усиливается активность катепсина S против коллагена IV типа [13], входящего в состав перицеллюлярного матрикса хондроцитов. Кроме того, гепарин и гепарансульфат стабилизируют структуру катепсина В, увеличивая период его активности в нейтральной и щелочной среде в 5 раз.

Существенную роль в ограниченном протеолизе, приводящему к изменению свойств молекул внеклеточного матрикса, отводят металлопротеазам. Однако протеазы лизосом помимо основной своей функции - деградации белков, участвуют в процессинге сигнальных молекул, таких, как факторы роста и цитокины [1, 4], осуществляя свою регуляторную роль в матриксе ткани. Кроме того, показано, что катепсин D обладает самостоятельным митогенным эффектом, не связанным с его протеолитическими свойствами [2]. Не исключено, что эффектами сигнальных молекул также обладают комплексы цистеиновых протеаз с их специфическими ингибиторами - цистатинами.

Известно, что катепсин B наряду с сериновыми протеазами, расщепляя гликопротеины гликокаликса клеток, приводит к нарушению прикрепления клеток матриксу, к потере гиалуронана вследствие расщепления связывающих его белков [6], что может быть весьма критичным для насыщенной гиалуронаном хрящевой ткани. Изменение передачи сигналов от молекул матрикса к клетке из-за расщепления ее рецепторов является дополнительным эффектом действия катепсина B. Показано, что катепсин В способен инициировать апоптоз клеток [4, 10].

Катепсин L способен расщеплять многие белки матрикса, включая коллаген I типа, однако, с меньшей скоростью, чем катепсин K [1]. Его регуляторная роль показана на примере участия катепсина L в ангиогенезе при опухолевом росте, заключающаяся в альтернативном процессинге эндостатина [13]. Микроциркуляция является лимитирующим фактором в консолидации краев дефекта кости, поэтому не исключено, что катепсин L может принимать участие в этом процессе за счет стимуляции ангиогенеза.

Таким образом, лизосомальные протеазы представляют область повышенного интереса в патологии хрящевой и костной тканей. Получение этих протеаз из различных органов и тканей могло бы стать полезным при исследовании клеток хондроцитов и остеобластов invitro. Выделение катепсинов из лизосом составляет более простую задачу, чем выделение металлопротеаз, поскольку вклад лизосомального протеолиза в общий катаболизм белка составляет 70 % [2]. Однако для выбора источника выделения лизосомальных протеаз необходимо исследовать активность данных ферментов в различных органах. Крысы широко применяются в лабораторных исследованиях, имеют существенную массу, и поэтому их органы могут быть использованы как источники лизосомальных ферментов.

В соответствии с изложенным выше, целью работы явилась оценка активности катепсинов B, L, D и S в различных внутренних органах крыс, как источниках лизосомальных протеолитических ферментов для исследования их влияния на клетки хрящевой и костной тканей.

Материалы и методы

Работа выполнена на 10-ти самках крыс Wistar в возрасте 3,5 месяцев массой 280-350 г. Животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом. Извлеченные печень, почку и селезенку промывали 0.25 М сахарозой с 1 мМ ЭДТА, рН 7.3. Кусочки органов гомогенизировали тефлоновым пестиком с помощью механического гомогенизатора с электрическим приводом в холодной сахарозе в соотношении 1:9 (w/v). Гомогенаты хранили при -20 °С не более 4-х недель. Перед определением активности гомогенаты разводили 0,2 % тритоном Х-100 в соотношении 1:1 (v/v).

Активность протеаз и концентрацию белка определяли согласно [2].

Активность катепсина В определяли в 0.1М фосфатном буфере, рН 6.0 с помощью 10 мкМ флуоресцентного субстрата Z-Arg-Arg-NMCA (НПО «Вектор», Россия).

Активность катепсина L определяли в 0.1М ацетатном буфере, рН 5.5 против 10 мкМ субстрата Z-Phe-Arg-NМСА (НПО «Вектор», Россия) в присутствии 1 нМ селективного ингибитора катепсина В CA-074 (любезно предоставлен профессором Кутунума, Япония).

Активность катепсина S определяли в 0.1 М фосфатном буфере, рН 6.5 с помощью 10 мкМ субстрата Z-Val-Val-Arg-МСА (Sigma, США) с добавлением 1 нМ СА-074и 1 мМфенилметилсульфонилфторида (Sigma, США) согласно. Реакционные смеси инкубировали 30 мин при 37 °С. Реакцию останавливали добавлением раствора 0.1 М монохлоруксусной кислоты в 0.1 М ацетатном буфере рН 4.3. Флюоресцирующие продукты реакции измеряли при l 355нм (возбуждение) и l 460 нм (эмиссия) на спектрофлуориметре Shimadzu RF-5301 (Япония). Удельную активность цистеиновых протеаз выражали в мкмольметилкумарилламида (МСА)/мин. на мг белка.

Активность катепсина D определяли в 0.1 М ацетатном буфере, рН 5.0 с добавлением 2 % азоказеина в 6 М мочевине равного объема, согласно. Реакцию останавливали 10 % раствором трихлоруксусной кислоты. Пробы центрифугировали в течение 10 мин, при 6000 об./мин определяли оптическую плотность супернатанта на спектрофотометре «Spekol 20» (KarlZeiss, Германия) при l 366 нм. Активность катепсина D выражали в условных лабораторных единицах в расчете на мг белка (Е 366 /час на мг белка).

Проверка нормальности распределения исследуемых признаков производилась по критерию Шапиро - Уилка. В целях установления значимости различий показателей между независимыми группами, данные которых не подчиняются нормальному закону, была проведена статистическая обработка с помощью критерия Крускала - Уолиса с учётом поправки Бонферони для трёх групп.

Результаты и обсуждение

Активность катепсинов зависела от органов, в которых она определялась (табл. 1).

Активность протеаз в органах крыс, выраженная в ед. активности на 1 мг белка

Эластиновая сеть межклеточного матрикса

У многоклеточных организмов большинство клеток окружено вне- или межклеточным матриксом. Межклеточный матрикс — сложный комплекс связанных между собой макромолекул.

Эти макромолекулы (белки и гетерополисахариды), как правило, секретируются самими клетками, а в межклеточном матриксе из них строится упорядоченная сеть.

На что влияет межклеточный матрикс:

прикрепление,
развитие,
пролиферацию,
организацию,
метаболизм.

Межклеточный матрикс вместе с клетками разного типа, которые в нём находятся (фибробласты, хондро- и остеобласты, тучные клетки и макрофаги), часто называют соединительной тканью.

Функции межклеточного матрикса:

образует каркас органов и тканей;
является универсальным «биологическим» клеем;
участвует в регуляции водно-солевого обмена;
образует высокоспециализированные структуры (кости, зубы, хрящи, сухожилия, базальные мембраны).

Основные компоненты межклеточного матрикса — структурные белки коллаген и эластин, гликозаминогликаны, протеогликаны, а также неколлагеновые структурные белки (фибронектин, ламинин, тенасцин, остеонектин и др.).

Эластин

Основной белок эластических волокон, которые в больших количествах содержатся в межклеточном веществе кожи, стенок кровеносных сосудов, связках, лёгких. Эти ткани могут растягиваться в несколько раз по сравнению с исходной длиной, сохраняя при этом высокую прочность на разрыв.

Эластин является менее изученным фибриллярным белком, чем коллаген и представляет собой основной компонент эластических волокон соединительной ткани.

Основная функция эластина состоит в обеспечении эластических свойств тканей:

Мономеры эластина организованы в волокна, настолько прочные и устойчивые, что функционируют в течение всей жизни организмов;
Прочность этих волокон обусловлена образованием ковалентных сшивок между боковыми цепями лизина, находящегося в соседних мономерах эластина;
Эластичность волокон связана с наличием гидрофобных областей, которые при приложении силы растягиваются, а при снятии нагрузки спонтанно сокращаются;
Сборка волокон тропоэластина происходит во внеклеточном пространстве и находится под контролем трехступенчатого процесса;
Мутации в гене эластина являются причиной развития разнообразных патологических состояний, начиная от образования морщин на коже и заканчивая ранней детской смертностью.

Если способность коллагена к упругому растяжению невелика, то эластин является резиноподобным полимером. Он содержится в большом количестве в межклеточном матриксе тех тканей, которые испытывают периодические растяжения и сокращения, таких, например, как крупные кровеносные сосуды, связки, легкие. В аорте эластин составляет 30-60% от массы вещества ткани, а в выйной связке его содержание доходит до 70-80%.

Особенности первичной структуры эластина:

Эластин содержит в своем составе около 800 аминокислот и характеризуется таким же монотонным и однообразным аминокислотным составом, как коллаген. Он также содержит много остатков глицина и пролина, однако в отличие от коллагена в нем очень мало остатков гидроксипролина, отсутствует гидроксилизин и, наоборот, содержится необычно много валина и других гидрофобных аминокислот.

Особенности вторичной структуры эластина:

Наличие большого количества гидрофобных радикалов в эластине препятствует созданию стабильной глобулы, в результате чего его полипептидные цепи не формируют регулярную вторичную и третичную структуры, а принимают в межклеточном веществе разные конформации.

Нарушения структуры эластина и их последствия:

Снижение активности лизилоксидазы, вызванное дефицитом меди, пиридоксина или дефицит лизилоксидазы, связанный с генетическим дефектом, приводит к снижению или прекращению образования десмозинов. В результате поперечных сшивок нет или их недостаточное количество. При этом, у эластических тканей снижается предел прочности на разрыв, появляются такие нарушения, как истончённость, вялость и растяжимость. Клинически эти нарушения могут проявляться кардиоваскулярными изменениями (аневризмы и разрывы аорты, дефекты клапанов сердца), частыми пневмониями и эмфиземой лёгких.

Каждый тип соединительной ткани имеет свои специфические наборы молекул

Образование матрикса, его распад или ремоделирование - все это важные и необходимые процессы, участвующие при перестройке тканей. Они сопутствуют развитию организма, заживлению ран, некрозу опухолей или воспалению.

Ключевыми компонентами обмена молекул внеклеточного матрикса и его регуляции являются металлопротеазы матрикса (МПМ) и их ингибиторы (тканевые ингибиторы металлопротеаз матрикса ТИМПМ). Семейство МПМ состоит из металлопротеаз матрикса мембранного типа (МПМ-МТ), которые активируют прожелатиназу А, и каскада металлопротеаз матрикса, которые полностью разрушают молекулы матрикса.

МПМ - это группа ферментов, активность которых зависит от цинка. Они катализируют распад молекул внеклеточного матрикса (протеогликаны, гликопротеины и различные типы коллагена). Клетки секретируют МПМ в форме прометаллопротеаз. Механизм их активирования in vivo пока не известен.

Фермент	Молекулярная масса	Субстрат
МПМ
Желатиназы 72 кД желатиназа (МПМ-2; тип IV, коллагеназа А)	Денатурированный коллаген, Коллаген IV, V, VII, X, эластин, фибронектин
92-кД желатиназа (МПМ-9; тип IV коллагеназа B)	Желатин, коллаген IV, V, фибронектин
Коллагеназы Интерстициальная коллагеназа ( фибробластный тип коллагеназы, МПМ-1)	Колаген типов I-III, VII, VIII, X
Нейтрофильная коллагеназа (ПМЯ тип коллагеназы, МПМ-8)	75-85	Коллаген типов I-III
Коллагеназа-3 (МПМ-13)	Коллаген типов I-III, VII VIII, X
Стромализины Стромализин-1 (МПМ-3; Транзин)	57-60	Протеогликаны, фибронектин, ламинин, денатурированный коллаген
Стромализин-2 (МПМ-10, Транзин-2)	Коллаген III-IV, фибронектин, желатин, предшественники МПМ
Стромализин-3 (МПМ-11)	альфа-1-антитрипсин
Матрилизин (МПМ-7, pump-1)	Фибронектин, ламинин, протеогликаны, желатин, эластин, энтактин
Металлоэластаза (МПМ-12)	Эластин, фибронектин
Мембранные МПМ MT-МПМ (МПМ-14) MT-МПМ-2 MT-МПМ-3	Прожелатиназа-А
Сериновые протеиназы
Урокиназный тип активатора плазминогена	Гликопротеины, аморфный коллаген
Тканевой активатор плазминогена	Гликопротеины, аморфный коллаген

Примечание: pump-1 - путативная металлопротеиназа

Полагают, что активирование ферментов часто осуществляется путем аутокатализа, результатом которого является удаление N-концевого пептида протеазы. In vitro МПМ могут быть активированы детергентами или органическими производными ртути и такими протеолитическими ферментами как плазмин, трипсин, калликреин, стромализин. Все эти агенты индуцируют конформационные изменения, направленные на образование промежуточной формы частично активированного фермента, который аутокаталитически удаляет часть молекулы с образованием полностью активного фермента.

Биологическое время полураспада БУК колеблется от нескольких дней (протеогликаны кожи) до нескольких месяцев (зрелый коллаген кожи).

Химические компоненты хряща

Одним из главных химических компонентов хряща является тип II коллагена. Другим важным компонентом является специфический для хряща протеогликан. Конечная функция хряща определяется функцией этих 2 основных типов молекул. Коллагеновые волокна, прочные на разрыв, усиливают механические свойства довольно непрочного протеогликана. Ориентация коллагеновых волокон определяется направлением воздействий, которым эта ткань противостоит. Протеогликан образует гель, который в 5 раз больше по объему в воде, чем в окружении коллагена. Причем, возможности связывания воды гелем зависят от взаимодействия между этими двумя основными белками хряща. Не исключено, что на это свойство влияют и другие белки хряща.

Главный коллагеновый белок хряща - коллаген II типа [a(II)]₃ .Он состоит из 3 одинаковых a-цепей, гомологичных по аминокислотному составу a-цепям коллагена кожи. Коллаген II типа относится к классу главных структурных коллагенов, для которых характерно образование поперечно исчерченных прочных фибрилл. Его волокна разнообразны по диаметру, но, как правило, они тоньше волокон коллагена I типа и имеют больше поперечных ковалентных связей. Из хряща выделены и другие типы коллагена, которые составляют около 10 % от общего количества коллагена в хряще. Эти минорные коллагены отличаются по аминокислотному составу, молекулярной массе и свойствам. Их роль пока еще недостаточно хорошо выяснена.

Главный протеогликан хряща занимает 5-10% от влажного веса хряща. К белковому компоненту протеогликана с ММ 210000 Да присоединяется ковалентными связями несколько типов боковых цепей. В белке ПГ выделяют несколько доменов. На N-конце имеется глобулярный домен (G1), имеющий одну одиночную и одну двойную петли. При помощи этого домена белковая цепь ПГ взаимодействует с гиалуроновой кислотой. Место контакта образовано из 5 дисахаридных структур гиалуроновой кислоты. Несколько таких белковых цепей ПГ могут взаимодействовать с одной молекулой гиалуроновой кислоты. Связь между белком и гиалуроновой кислотой усиливается при помощи специального связывающего белка. По своей структурной организации этот белок гомологичен домену белковой части ПГ, связывющемуся с гиалуроновой кислотой.

Клеточные контакты и внеклеточные структуры, коллаген. Структура и функции базальных мембран

Большинство клеток у многоклеточных животных кооперируется в организованные ансамбли, называемые тканями, которые в свою очередь в различных комбинациях объединяются в более крупные функциональные единицы - органы. Клетки в тканях связаны друг с другом в специализированных местах контакта, называемых клеточными соединениями. Клеточные соединения могут быть разделены на 1) прикрепительные контакты, которые механически связывают клетки и их цитоскелеты с соседними клетками или внеклеточным матриксом; 2) коммуникационные контакты, по которым передаются химические или электрические сигналы между взаимодействующими клетками. В свою очередь прикрепительные контакты делятся на рыхлые или простые контакты, плотные контакты и десмосомы. Клетки в простых контактах разделяет щель шириной 20 нм, в плотных контактах - до 10 нм. Десмосомы это высокоспециализированные контакты. К внутренней стороне каждой мембраны прилегают промежуточные филаменты из прекератина. Без таких поддерживающих структур многоклеточные объединения в виде тканей и органов и особенно сосудистые стенки не смогли бы выдержать даже ничтожное напряжение. Коммуникационные контакты делятся на щелевые контакты и химические синапсы. Щелевые контакты шириной 2 нм формируются за счет трансмембранных белков-каналов, соединяющих внутренность двух клеток. Через такие каналы из одной клетки в другую могут перемещаться неорганические ионы и другие молекулы и частицы с массой до 1500 дальтон. Щелевые контакты имеют особое значение для координации функций электрически активных клеток. В этом случае их называют электрические синапсы. Существуют еще химические синапсы, Строение и функции химических синапсов или просто синапсов будут детально рассмотрены в лекции по нервно-мышечной физиологии.

Рис. 10 Строение щелевого контакта

Ткани состоят не только из клеток. Значительную часть объема ткани занимает внеклеточное пространство или внеклеточный матрикс. Он заполнен сложной сетью макромолекул, главным образом, разнообразными полисахаридами и белками. Внеклеточный матрикс способствует поддержанию многоклеточных структур, создавая каркас, внутри которого клетки могут мигрировать и взаимодействовать друг с другом. Животные ткани можно разделить на две главные группы, в которых роль матрикса и межклеточных соединений существенно различаются - эпителиальные и соединительные. Эпителиальные клетки выстилают различные внутренние полости, например кишечник, и свободные поверхности тела. Внеклеточного матрикса в эпителии мало, а клетки плотно прилегают друг к другу, образуя пласты, воспринимающие большую часть нагрузок на орган. Благодаря запирающим соединениям между клетками (десмосомам) эти пласты могут служить барьерами для передвижения воды и солей и разделяют жидкости различного химического состава. Эпителии почти всегда располагаются на подложке из соединительной ткани, которая может связывать их с другими тканями (например, мышечной), не имеющими явно выраженной эпителиальной или соединительнотканной организации. В соединительных тканях имеется обширный внеклеточный матрикс, в котором клетки располагаются весьма свободно. Матрикс богат волокнистыми полимерами, которые армируют подобно тому, как железные прутья армируют железобетон, и поэтому матрикс, а не клетки, берет на себя большую часть нагрузок, которым подвергается ткань. Главным фибриллярным белком внеклеточного матрикса является коллаген, название которого произошло от греческого слова kolla - клей, поскольку коллаген - вещество, которое промышленным способом извлекается из костей и используется для получения желатина и клея. К настоящему времени выявлено около 20 различных типов коллагена, каждый из которых кодируется отдельным геном.

В коллагене найдены уникальные аминокислоты - гидроксипролин и гидроксилизин. Гидроксипролин, представленный в коллагене весьма большим числом остатков, стабилизирует тройную спираль коллагена по отношению к действию протеаз. В отличие от гидроксилизина, гидроксильная группа которого служит местом присоединения остатков галактозы и глюкозы , гидроксильные группы гидроксипролина в коллагене остаются незамещенными. Гидроксилирование пролина (или лизина) катализируется пролилгидроксилазой (или лизилгидроксилазой) - ферментами, находящимися в микросомальной фракции многих тканей(кожи, печени, легких, сердца, скелетной мышцы, гранулирующих раневых поверхностей). Установлено, что аскорбиновая кислота является существенным фактором многих реакций типа RH + O—>ROH. Роль восстановителя в таких процессах может показаться парадоксальной, но это не так, если принять во внимание, что витамин С может образовывать окислительно-восстановительную пару аскорбиновая кислота/дегидроаскорбиновая кислота. Аскорбиновая кислота участвует в метаболизме некоторых аминокислот, способствуя образованию гидроксипролина, гидроксилизина, норадреналина, серотонина и карнитина. Коллаген, синтезированный при недостатке или отсутствии витамина С, не способен к образованию полноценных волокон, что является причиной поражения кожи, ломкости сосудов и других признаков, характерных для цинги.

Другой белок внеклеточного матрикса - эластин. Обширная сеть волокон эластина придает коже, кровеносным сосудам и легким способность возвращаться к исходному состоянию после растяжения или сжатия. Благодаря различиям в соотношениях различных типов макромолекул и в способе их организации существует необычайное разнообразие форм внеклеточного матрикса, каждая из которых очень хорошо приспособлена к функциональным потребностям данной ткани. В сухожилиях матрикс может принимать форму каната, что придает им огромную прочность на разрыв. Матрикс может обызвествляться, образуя твердые, как камень, структуры кости или зуба, может формировать прозрачное вещество роговицы глаза.

На границе между эпителием и соединительной тканью матрикс образует базальную мембрану - тонкую, но плотную прокладку, состоящую, в основном, из параллельно уложенных волокон коллагена. Кроме опорной роли для эпителия базальная мембрана может выполнять некоторые специализированные функции, например, в почечных клубочках она действует как молекулярный фильтр, регулируя переход молекул из крови в мочу.

Виды и функции протеаз внеклеточного матрикса

Несмотря на используемые в настоящее время схемы консервативного лечения, примерно у каждого четвертого пациента после инфаркта миокарда развивается хроническая сердечная недостаточность (ХСН), имеющая высокие показатели 5-летней смертности (более 50%). Именно поэтому изучение и понимание механизмов развития сердечной недостаточности является крайне актуальным. Матриксные металлопротеиназы (ММП) являются ключевыми ферментами, участвующими в ремоделировании миокарда левого желудочка. В то же время остаются не до конца решенными вопросы влияния ММП на базальные мембраны кардиомиоцитов. Именно базальные мембраны являются связующим звеном между внеклеточным матриксом и кардиомиоцитами, участвуя в передаче силы сокращений во время систолы. Одной из наиболее хорошо изученных является матриксная ММП-9. Более четкое понимание роли этой ММП, особенно в отношении разрушения коллагена IV типа в базальных мембранах кардиомиоцитов, возможно, позволит оптимизировать стратегию лечения ХСН после инфаркта миокарда и будет способствовать улучшению прогноза у этой тяжелой категории пациентов. Настоящий обзор посвящен изучению влияния ММП-9 на ремоделирование миокарда левого желудочка.

Ключевые слова: матриксные металлопротеиназы, сердечная недостаточность, коллаген IV типа, ремоделирование миокарда левого желудочка, инфаркт миокарда, сердечная недостаточность.

Matrix metalloproteinase 9 in the left ventricular remodeling

D.V. Shumakov, D.I. Zybin, M.A. Popov

Moscow Regional Clinical Research Institute named after M.F. Vladimirsky, Moscow

Nowadays, chronic heart failure after myocardial infarction (MI) develops approximately in one of four patients and has a high five-year mortality rate (more than 50%), despite modern conservative treatment regimens. That is why understanding the mechanisms of heart failure is extremely relevant. Matrix metalloproteinases are key enzymes involved in left ventricular remodeling. At the same time, an issue concerning the effect of metalloproteinases on the basal cardiomyocyte membranes remains incompletely resolved. It is the basal membranes that are the link between the extracellular matrix and cardiomyocytes, participating in the transmission of the force of contractions during systole. One of the most well-studied is matrix metalloproteinase 9 (MMP-9). A more comprehensive study of MMP-9, especially in relation to the type IV collagen destruction in the basal cardiomyocyte membranes, may help to optimize the chronic heart failure treatment tactics after MI and to improve the prognosis for difficult-to-treat patients. This review is devoted to the study of the MMP-9 effect on left ventricular remodeling.

Keywords: matrix metalloproteinases, heart failure, type IV collagen, left ventricular remodeling, myocardial infarction.

For citation: Shumakov D.V., Zybin D.I., Popov M.A. Matrix metalloproteinase 9 in the left ventricular remodeling. RMJ. 2020;10:17-19.

Для цитирования: Роль матриксной металлопротеиназы 9 в ремоделировании миокарда левого желудочка. РМЖ. 2020;10:17-19.

Актуальность

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смерти и инвалидизации населения во всем мире, несмотря на значительные успехи в лечении и профилактике [1]. В то же время хроническая сердечная недостаточность (ХСН), развивающаяся вследствие раннего постинфарктного ремоделирования левого желудочка (ЛЖ), занимает одно из первых мест в структуре смертности от ССЗ. Ремоделирование миокарда, возникающее после инфаркта миокарда (ИМ), обусловлено изменением структуры внеклеточного матрикса (ВКМ) [2]. В свою очередь, повышение уровня матриксных металлопротеиназ (ММП) взаимосвязано с ремоделированием ЛЖ, его дисфункцией и, как следствие, развитием ХСН.

Характер ремоделирования миокарда после ИМ зависит от степени поражения артериального русла, выраженности воспалительного ответа и многих других процессов, которые происходят во время формирования рубцовой зоны. В ответ на повреждение кардиомиоцитов запускается ряд защитных механизмов — воспаление, пролиферация и созревание клеток [3]. Каждый из них вносит свой вклад во временные изменения уровней ММП в миокарде. ММП в зоне формирования рубца секретируются различными клетками: нейтрофилами, макрофагами, эндотелиальными клетками, поврежденными кардиомиоцитами и фибробластами. Процессы, происходящие в некротизированном и ишемизированном миокарде, делают MMП ключевыми медиаторами в прогрессирующем ремоделировании миокарда ЛЖ 6.

Внеклеточный матрикс и процесс ремоделирования миокарда ЛЖ

Внеклеточный матрикс составляет основу соединительной ткани, обеспечивающей механический каркас клеток и транспорт химических веществ (табл. 1) [8].

Благодаря трехмерно организованной структуре, которая взаимосвязана с волокнами миокарда, достигается прочность и эластичность ВКМ. Коллаген I типа составляет примерно 70-85% общей массы ВКМ и обеспечивает его прочность. Коллаген III типа составляет около 10% общего сердечного коллагена, обеспечивая эластичность ВКМ 11.

Ремоделирование миокарда при ИМ патофизиологически обусловлено гибелью кардиомиоцитов в результате длительной ишемии, которая приводит к активации ММП, что в свою очередь становится причиной деградации ВКМ, нарушающей структурную целостность. Все это в конечном счете приводит к снижению как систолической (из-за гибели кардиомиоцитов), так и диастолической (деградация ВКМ) функции [14].

Ремоделирование миокарда ЛЖ в области ИМ проходит в несколько этапов [15, 16]. Эти этапы (воспаление, пролиферация и отложение коллагена) последовательны и важны для ограничения зоны инфаркта. Исход ремоделирования миокарда зависит от выраженности каждого из этих этапов и их соотношения.

Гомеостаз кардиомиоцитов ухудшается сразу после ишемии, и уже через 30 мин клетки погибают, что в свою очередь провоцирует активацию нейтрофилов и макрофагов, т. е. острую воспалительную реакцию 18. Нейтрофилы и макрофаги, проникая в область ИМ, высвобождают медиаторы воспаления, в т. ч. ММП и тканевой ингибитор металлопротеиназ. Примерно на 5-й день после ИМ начинает формироваться рубец, богатый коллагеном, восполняющий потерю кардиомиоцитов в области инфаркта [20].

Базальная мембрана кардиомиоцитов

В дополнение к коллагенам I и III типов, формирующим основу ВКМ, существуют белки, находящиеся в базальной мембране кардиомиоцитов: коллаген IV, V, VII, X и XIV типов, а также ламинин 13.

Базальная мембрана представляет собой плотную сеть различных белков, которая окружает кардиомиоциты, включает ламинин, коллаген IV типа и ряд протеогликанов [21, 22]. Она рассматривается как самостоятельная форма ВКМ, поскольку содержит коллаген IV типа, обнаруженный только в базальной мембране, и является слоем, отграничивающим ВКМ от кардиомиоцитов.

Фрагментация базальной мембраны происходит уже через 1 ч после ИМ и продолжается до 7 дней после реперфузии [23]. В исследованиях было показано увеличение толщины базальной мембраны, что способствует нарушению диффузии кислорода и возникновению гипоксического стресса [24]. Кроме того, после начала ИМ начинают вырабатываться антитела против коллагена IV типа, что также приводит к нарушению структурной целостности базальной мембраны и, следовательно, дисфункции эндотелиальных клеток [25]. В свою очередь, белки, образующиеся после распада ламинина, стимулируют заживление зоны некроза и ангиогенез [26]. Белки, являющиеся результатом деградации коллагена IV типа, напротив, играют критическую роль в подавлении ангиогенеза, нарушении структурной целостности сосудов и межклеточных взаимодействий после ишемического повреждения миокарда [27].

Матриксные металлопротеиназы

ММП представляют собой семейство цинкзависимых эндопептидаз, которые регулируют обмен белков соединительной ткани, а также влияют на процесс нормального развития и ремоделирования ВКМ. ММП широко изучаются в качестве маркеров для прогнозирования ремоделирования ЛЖ после ИМ и развития СН [28, 29]. Большое количество публикаций подчеркивают важность этого фермента в списке перспективных и важных биомаркеров, которые могут быть использованы для улучшения диагностики и повышения эффективности лечения ССЗ [30].

В таблице 2 перечислены наиболее изученные ММП и их биологические функции [8].

ММП-9, или желатиназа B, — одна из наиболее хорошо изученных протеаз, регулирующих патологические процессы ремоделирования. MMП-9 играет главную роль в деградации ВКМ при различных физиологических и патофизиологических процессах, которые включают ремоделирование ткани.

ММР-9 секретируется большим количеством клеток, включая кардиомиоциты, эндотелиальные клетки, нейтрофилы, макрофаги и фибробласты [30]. S. Blankenberg et al. первыми стали использовать ММП-9 в качестве нового прогностического биомаркера развития дисфункции ЛЖ и поздней выживаемости [31]. Вместе с другими исследователями [32] они показали взаимосвязь повышенного содержания MМП-9 с высокой концентрацией интерлейкина 6, C-реактивного белка и фибриногена в плазме, что свидетельствует о высоком прогностическом значении ММП-9.

I.B. Squire et al. [33] продемонстрировали, что увеличение содержания MMП-9 ассоциируется с большими объемами ЛЖ и дисфункцией ЛЖ после ИМ. Оценив количественный уровень ММП-9 в течение 5 дней после ИМ у 60 пациентов, авторы пришли к выводу, что, опираясь на уровень ММП-9, можно судить о характере ремоделирования миокарда после ИМ: чем он выше, тем хуже прогностический результат.

ММП-9 регулирует ремоделирование миокарда, непосредственно разрушая ВКМ и активируя цитокины и хемокины [30]. Воздействие ММП-9 является как вредным, так и полезным для регенерации зоны инфаркта. С одной стороны, под действием ММП-9 снижается фагоцитоз макрофагов и пролонгируется воспалительный ответ нейтрофилов, что приводит к увеличению ЛЖ после ИМ [34]. С другой стороны, происходит расщепление остеопонтина, что сопровождается образованием двух биологически активных пептидов, которые увеличивают скорость миграции фибробластов сердца, что, в свою очередь, ускоряет заживление инфарцированной зоны [35]. По этой причине использование ММП-9 в качестве диагностического маркера в различные дни после ИМ может помочь в прогнозировании и предотвращении дисфункции ЛЖ после ИМ.

Отдельно стоит отметить роль ММП-9 в разрушении коллагена базальных мембран кардиомиоцитов, в частности коллагена IV типа. В недавно опубликованной работе авторы, используя иммуногистохимический метод исследования, показали накопление ММП-9 в цитоплазме кардиомиоцитов, которое сочеталось с частичным или полным разрушением базальных мембран кардиомиоцитов, образованных коллагеном IV типа [36].

Заключение

ССЗ являются наиболее распространенной причиной смерти в развитых странах [37], а ИМ вносит значительный вклад в смертность от ССЗ [38]. По разным оценкам, распространенность ССЗ увеличится на 10% в течение следующих 20 лет и к 2030 г. станет причиной 23,6 млн смертей ежегодно во всем мире [39]. Кроме того, расходы на общественное здравоохранение в связи с ИМ увеличатся в 3 раза в течение следующих двух десятилетий [40].

После ИМ ЛЖ претерпевает ряд изменений на молекулярном и клеточном уровнях. Изменяется и ВКМ, со временем изменяя геометрию ЛЖ и нарушая его функцию [41]. Деградация ВКМ определяет прогноз в раннем и отдаленном периодах после ИМ [42]. Оценка ВКМ в различные периоды после ИМ может дать ранние диагностические или прогностические показатели ремоделирования ЛЖ и позволить группировать пациентов, учитывая их индивидуальные риски и дальнейшее лечение. В настоящее время используются различные биомаркеры для своевременной диагностики ИМ, однако их применение ограниченно
из-за отсутствия специфичности и селективности [43].

Определение роли MMП-9 в ремоделировании после ИМ является важной задачей [44]. Лучшее понимание патофизиологических процессов, в т. ч. биологической функции ММП-9, возможно, позволит разработать новые стратегии диагностики и лечения для пациентов, перенесших ИМ.

Биомаркеры ремоделирования ВКМ, которые возможно обнаружить при структурных изменениях во время ИМ, могут помочь в прогнозировании дальнейшего развития ХСН. В частности, одним из таких маркеров может выступать коллаген IV типа, находящийся в базальных мембранах кардиомиоцитов и разрушающийся под воздействием ММП-9. Одновременный анализ уровня ММП-9 и содержания коллагена IV типа в миокарде позволит ввести критерии прогноза выживаемости данной группы больных, определения тактики лечения, а также лучшего понимания процессов ремоделирования.

Список литературы Свернуть Развернуть

Контент доступен под лицензией Creative Commons «Attribution» («Атрибуция») 4.0 Всемирная.

Читайте также: