Набор тест-систем для сбора и концентрирования вирусов на основе сорбции вирусных частиц вы
| Позиция | Кол. | Ед. изм | Цена | Сумма | Доля |  |  | ||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1. набор тест-систем для сбора и концентрирования вирусов на основе сорбции вирусных частиц высокоэффективным сорбентом, изготовленным согласно мук 4.2.2357-08 | 4 | НАБОР | 48 000,00 ₽ | 192 000,00 ₽ | 100,00 % | ||||||||||||||||
| В закупочной документации не найдены недействующие или несуществующие стандарты и нормы |
| Продавец |
|---|
| Общество с ограниченной ответственностью «ТехТрейдСервис" ИНН 7814602568, КПП 781401001 Вероятные контактные данные: 7-812-9073596, disprod@yandex.ru |
Протокол подведения итогов
| Наименование участника | Ценовое предложение | ИНН | КПП | Вероятные контактные данные |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Общество с ограниченной ответственностью «ТехТрейдСервис" | 7814602568 | 781401001 | 7-812-9073596, 8-812-907-35-96, 7-8362-553000 , disprod@yandex.ru |
опубликовано
Посмотреть все закупки заказчика
Карточка будет добавлена в Избранное
В случае публикации текущей закупки, она заменит отслеживаемую будущую, Вы получите уведомление
Понравилась закупка? Оцените свои возможности, примите решение об участии, подготовьте необходимые документы
Вы подали заявку на участие в аукционе?
Допущены к торгам?
Организатор торгов отклонил Вашу заявку и Вы не согласны с данным решением?
Аукцион! Выигрывает тот, кто предлагает наиболее выгодные условия и цену.
Ожидайте результатов аукциона, отслеживайте соблюдение сроков:
Вы победитель? Поздравляем! Предоставьте Заказчику обеспечение исполнения контракта и подпишите контракт
Строго соблюдайте сроки. Соотношение рабочих и выходных дней не принципиально:
Соотношение рабочих и выходных дней принципиально:
Преимущества для Субъектов Малого Предпринимательства и Социально Ориентированных Некоммерческих организаций:
- Сумма обеспечения - до 2% от стоимости контракта.
- Оплата закупки - не более 15 дней с момента подписания документа о приемке.
Возможно увеличение цены контракта до 15%, но не более начальной цены в случаях:
- Если продавец - организация инвалидов
- Если продавец - предприятие уголовно-исполнительной системы
- Товарам/работам/услугам, произведенным на территории государств - членов Евразийского экономического союза
В данной закупке могут принималь участие только организации - субъекты малого предпринимательства и социально ориентированные некоммерческие организации
Установлен запрет на продажу товаров, происходящих из иностранных государств, работ, услуг, соответственно выполняемых, оказываемых иностранными лицами
В отношении участников закупки установлено требование о привлечении к исполнению договора субподрядчиков (соисполнителей) из числа субъектов малого и среднего предпринимательства
Участниками закупки могут быть только субъекты малого и среднего предпринимательства
Ловушечное устройство состоит из насадки на водопроводный кран, к которой с помощью синтетической трубки прикреплен держатель. В держатель, состоящий из двух свинчивающихся частей с резьбой, вставляется специальная ловушка, внутри которой находится адсорбент, сорбирующий вирусы из воды. Применяемая ловушка является одноразовой, а само устройство может использоваться после стерилизации многократно в соответствии с прилагаемой инструкцией.
5.6.1. Область применения.
Метод используют для концентрирования вирусов из водопроводной воды.
5.6.2. Подготовка ловушечного устройства и фильтрование воды.
Перед использованием в ловушечное устройство вставляют ловушку, после чего его заворачивают в бумагу для стерилизации и стерилизуют сухим жаром при температуре 80 °С 45 мин. Ловушечное устройство с вставленной ловушкой доставляют на место отбора в стерильной упаковке. После трехкратного обжигания водопроводного крана и спуска воды в течение 15 мин. устанавливают необходимую скорость ее протекания - 1 л за
1,5 мин., что составляет 40 - 45 л/ч. Ловушечное устройство извлекают из стерильной упаковки и устанавливают его на кран. Объем пропускаемой воды должен составить 1000 л, что достигается при скорости тока воды 40 - 45 л/ч в течение 24 ч. Спустя 24 ч ловушечное устройство снимают с крана и помещают в стерильный пакет, который доставляют в вирусологическую лабораторию. После извлечения ловушки использованное ловушечное устройство подвергают обеззараживанию в 3% растворе перекиси водорода в течение 12 ч, затем многократно (не менее 10 раз) промывают в проточной воде и высушивают для последующей стерилизации и повторного использования.
5.6.3. Элюция сконцентрированных вирусных частиц.
Ловушку с адсорбентом в стерильных условиях извлекают из ловушечного устройства и помещают в чашку Петри. С помощью ножниц ловушку вскрывают, содержащийся внутри адсорбент вымывают в чашку Петри стерильной дистиллированной водой в объеме 5 - 10 мл. Полученную взвесь адсорбента в дистиллированной воде переносят с помощью пипетки с отпиленным концом в стеклянную колонку. Вытекающую из колонки воду собирают в стерильный пенициллиновый флакон. Элюцию вирусов осуществляют с помощью специального элюента, содержащегося в наборе. Для получения рабочего раствора концентрат разводят стерильной дистиллированной водой в соотношении 1:10 (объем элюента/объем воды). Вирус элюируют путем пропускания 3 мл элюента через адсорбент в колонке. Полученную фракцию (элюат) собирают в стерильный пенициллиновый флакон.
Использованный адсорбент заливают 3% раствором перекиси водорода для обеззараживания на 12 ч.
С целью увеличения эффективности обнаружения вирусов в элюатах проб воды при исследовании методом ПЦР (обнаружение РНК энтеровирусов) и ИФА (обнаружение антигенов энтеровирусов) проводят дополнительное концентрирование элюатов с помощью ультрацентрифугирования либо обрабатывают элюаты полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ 6000).
5.6.3.1. Ультрацентрифугирование элюата.
Ультрацентрифугирование проводят при 40000 - 50000 g в течение 2 ч с использованием угловых или бакет-роторов. В стерильную центрифужную пробирку наливают вируссодержащий элюат, а затем с помощью шприца на дно пробирки наслаивают 10 - 20% раствор сахарозы так, чтобы она занимала 5 - 10% от объема пробирки. После центрифугирования супернатант удаляют. Осадок ресуспендируют в 0,5 мл стерильной дистиллированной воды для ПЦР-исследований или в фосфатно-солевом твинсодержащем буфере (рН 7,2) для ИФА.
5.6.3.2. Обработка элюата полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ 6000).
В элюат добавляют ПЭГ 6000 и хлористый натрий, находящийся непосредственно в пробирках для центрифугирования, до конечных концентраций 10% и 0,5 М соответственно. Смесь тщательно перемешивают до растворения ПЭГ и затем выдерживают в течение 10 - 12 ч при 4 °С. Образовавшуюся суспензию центрифугируют при 10000 g в течение 1 ч или при 6000 g в течение 2 ч. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 0,5 мл стерильной дистиллированной воды для ПЦР-исследований или в фосфатно-солевом твинсодержащем буфере (рН 7) - для ИФА.
Очистка вирусов обычно осуществляется в три стадии:
1) осветление клеточного лизата;
2) концентрирование вирусной суспензии;
3) собственно очистка концентрированной суспензии.
Осветление нативных культуральных жидкостей проводится с целью удаления из них остатков клеток, упрощения дальнейшей очистки, и для облегчения эффективной обработки вирусов инактивирующими агентами. Осветление осуществляется методами фильтрации и центрифугирования. Часто оба указанных метода применяются в сочетании друг с другом, причем фильтрация сопровождает непрерывное центрифугирование.
Существует много способов концентрирования и очистки вирусов. Наиболее распространенные:
1. Методы преципитации. Преципитация (осаждение) нейтральными солями или органическими растворителями была первым методом, который применялся в крупномасштабном производстве очищенных вирусов, хотя многие вирусы более или менее нестабильны в присутствии органических растворителей.
2. Адсорбция-элюирование. Разработан процесс очистки и концентрирования, основанный на адсорбции вирусных частиц к нерастворимому комплексу, образуемому высокомолекулярным полимером этиленоксидом и ионами кальция. Сформированный с частицами вируса тройной комплекс выводится из системы преципитацией, а затем выделяется из смеси центрифугированием.
3. Ультрафильтрация. Ультрафильтрация представляет собой процесс, с помощью которого смесь веществ различной молекулярной массы в жидкой фазе подвергается разделению при прохождении ее под давлением через мембраны, имеющие определенный размер пор. Разделение происходит главным образом в зависимости от размеров молекул. Ультрафильтрация очень широко применяется для концентрирования вирусов и замены водной фазы вирусных суспензий перед дальнейшей очисткой.
4. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности. Применяется для полной очистки вирусов. Для использования градиентов плотности используют несколько сред, наиболее часто - сахарозу и хлорид цезия.
5. Метод ионообменной хроматографии. Концентрирование и очистку вирусов можно проводить с помощью колоночной ионообменной хроматографии. В качестве ионообменников обычно используют иониты, приготовленные на основе целлюлозы: ДЭАЭ, ТЭАЭ, эктеола и др.
6. Хроматография вирусов по размерам. Применяют сефадексы (молекулярные сита), которые позволяют разделить вирусы по величине частиц.
Оценка чистоты вирусных препаратов.Определение степени чистоты сложных субстанций (вирусные частицы) представляет значительные технические трудности. Гомогенный или монодисперсный, препарат вируса -это препарат, состоящий из частиц, однородных по размерам, форме, электрофоретической подвижности, плотности и антигенным свойствам. Эти критерии и лежат в основе методов, применяемых для проверки чистоты вирусных препаратов.
Для определения чистоты вирусных препаратов применяют следующие методы:
- электронная микроскопия вирусных частиц;
- центрифугирование в градиенте плотности.
В случае вирусных иммунобиологических препаратов, где очень сложная природа вирусных частиц может сделать трудными для оценки многие физико-химические критерии чистоты, главнейшей задачей очистки является удаление нежелательных иммуногенных и инфекционных материалов. В случаях, когда необходимо убедиться в отсутствии потенциальных контаминантов, таких, как сыворотка крови животных, наиболее подходящими являются серологические методы. Они в совокупности с другими физическими, химическими или биологическими тестами, придающими оценке препарата законную силу, составляют основу спецификации продукта.
Инактивация вирусов
При изготовлении некоторых препаратов (вакцин) вируссодержащую суспензию подвергают инактивации. Трудности производства инактивированных вакцин заключаются в необходимости строгого контроля за полнотой инактивации вируса. Методы инактивации делят на две общие группы: физические и химические. Наиболее часто в промышленном производстве используют химические методы.
Широкое применение в качестве инактивирующего агента получил формальдегид; для производства противоящурных вакцин во всем мире широко применяются азиридины; для инактивации вирусов ящура, болезни Ньюкасла, бешенства энцефалитов лошадей и др. используют β-пропиопактон.
Поскольку инактивирующие агенты легко реагируют с невирусными белками и некоторыми компонентами питательных сред, при выборе концентрации инактиванта необходимо учитывать степень чистоты препарата.
Физические инактивирующие агенты имеют ограниченное применение: ультрафиолетовый свет и ионизирующая радиация инактивируют нуклеиновые кислоты вирусов, при их применении необходимо учитывать, что повышение дозы облучения ведет к снижению антигеннности препарата. Тепловое воздействие на вирусы в целях уничтожения их инфекционности при сохранении иммуногенности также ограничено. Температура часто играет роль критического фактора при инактивации вирусов с применением химических средств.
Последнее изменение этой страницы: 2017-01-24; Нарушение авторского права страницы
Изобретение относится к прикладной вирусологии, конкретно к процессам выделения, очистки, модификации вирусов и вирусных препаратов, т.е. к процессам, связанным с концентрированием вирусов. При концентрировании вируса путем его связывания биоаффинным сорбентом, содержащим антитела к вирусу, иммобилизованные на полимерной основе, промывки и последующей десорбции, в качестве полимерной основы биоаффинного сорбента используют криогель поливинилового спирта с размером пор 0,04 - 2,0 мкм. Кроме того, биоаффинный сорбент может, согласно данному изобретению, содержать наряду с антителами иммобилизованные ферменты, модифицирующие вирус. Предлагаемый способ обладает преимуществами по сравнению с аналогами и прототипом; а) повышена эффективность способа; б) повышена универсальность. Изобретение может быть использовано как в научных исследованиях, так и при производстве вакцин и диагностикумов, а также в медицинской практике. 1 з.п. ф-лы.
Изобретение относится к прикладной вирусологии, конкретно к процессам выделения, очистки, идентификации, модификации вирусов и вирусных препаратов, т. е. к процессам, связанным с концентрированием вирусов. Изобретение может быть использовано как в научных исследованиях, так и при производстве вакцин и диагностикумов, а также в медицинской практике.
Известными методами концентрирования вирусных частиц в современной вирусологии являются многоступенчатые операции длительного высокоскоростного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы или глицерина, а также зонного электрофореза и др. [1], кроме того используется концентрирование вирусов с помощью биоаффинных сорбентов, содержащих иммобилизованные антитела к вирусу [2]. Последний подход характеризуется большей эффективностью и технологическими удобствами.
Так, известен способ биоаффинной очистки вируса кори, где используют носитель, содержащий иммуноглобулины сыворотки крови обезьян, ковалентно пришитые к поверхности модифицированных стеклянных бусинок [3]. Способ включает пропускание вирусосодержащей жидкости через хроматографическую колонку, заполненную биоаффинным сорбентом с иммуноглобулинами, ковалентно-пришитыми к стеклянному носителю, с последующей промывкой колонки 0,14М раствором NaCl и элюированием вируса 0,1М глициновым буфером при pH 2,3.
Недостатками такого способа является низкая биоспецифическая емкость используемого носителя (работает только поверхность стеклянных гранул), неспецифическая адсорбция стеклом посторонних примесей и хрупкость, характерные для стеклянных носителей вообще.
Известен способ биоаффинной очистки вирусов разных размеров, где для очистки вируса используется силикагель с контролируемыми размерами пор (0,05 - 1,0 мкм) с привитыми аффинными лигандами [4]. Способ состоит из аналогичных операций хроматографической очистки целевого продукта, что и в предыдущем случае, только для промывания используют 0,1М Na-фосфатный буфер (pH 7,0), а для элюирования применяют 0,05М Na-цитратный буфер (pH 3,0).
Недостатками этого способа являются сложность получения иммуносорбента, связанная с многостадийной схемой модификации неорганического носителя, а также характерная для таких материалов хрупкость. Кроме того, в рабочих жидкостях даже со слабощелочной реакцией среды (pH 7,5-8,5) кремнеземные матрицы гидролитически нестабильны, что приводит к растворению активной поверхности и прогрессивному снижению биоспецифической емкости.
Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является выбранный в качестве прототипа способ очистки вируса сумчатой болезни цыплят путем его сорбционного концентрирования при пропускании вирусосодержащих суспензий через колонку с иммуносорбентом, представляющим собой нерастворимый носитель - гранулированный агарозный гель (коммерческое название - сефароза-4B), к которому после активации бромцианом ковалентно пришиты иммуноглобулины [5] . Такой биоаффинный сорбент используют для чистки не очень крупных вирусов, размеры которых ее превышают 0,08 мкм.
Однако указанный способ концентрирования вируса малоэффективен при работе с крупными (0,1-0,5 мкм) вирусами. Кроме того, гранулированные агарозные гели, в частности сефароза, имеют высокую стоимость и поэтому не могут найти крупномасштабного применения. Бромциан, используемый для активации данного носителя является высокотоксичным соединением, работа с ним представляет опасность для персонала.
Задача предлагаемого изобретения - разработка эффективного, универсального и технологически упрощенного способа концентрирования различных вирусов, в том числе и самых крупных вирусов с размером частиц до 0,5 мкм.
Решение этой задачи достигается тем, что при концентрировании вируса путем его связывания биоаффинным сорбентом, содержащим антитела к вирусу, иммобилизованные на полимерной основе, промывку и последующую десорбцию, в качестве полимерной основы биоаффинного сорбента используют криогель поливинилового спирта с размером пор 0,04 - 2,0 мкм. Кроме того, биоаффинный сорбент может, согласно данному изобретению, содержать, наряду с антителами, иммобилизованные ферменты, модифицирующие вирус.
Оказалось, что выбор криогеля поливинилового спирта (ПВС) в качестве полимерной основы биоаффинного сорбента обеспечивает возможность технологического упрощения способа концентрирования вируса, повышение эффективности способа в целом, его универсальности, в том числе и в отношении самых крупных вирусов с размером частиц до 0,5 мкм.
Весьма важными свойствами криогелей ПВС является их биосовместимость, отсутствие токсичности, а также его доступностью и относительная дешевизна. Криогели ПВС образуются в результате замораживания концентрированных водных растворов ПВС, их выдерживания в замороженном состоянии в течение определенного времени и последующего оттаивания [6]. Сформированный таким образом макропористый криогель устойчив при температурах до 60-65 o C и имеет температуру плавления 80-100 o C. Он обладает выраженной макропористостью [6], т.е. отвечает одному из основных требований, предъявляемых к носителям, предназначенным для работы с вирусами. Согласно предлагаемому изобретению в качестве полимерной основы биоафинного сорбента предусматривается использование криогеля ПВС, имеющего поры размером 0,05-2,0 мкм. Такие поры обеспечивают свободное проникновение даже самых крупных вирусов внутрь гранул носителя, т. е. в связывании с вирусами участвуют аффинные лиганды всего объема носителя.
Кроме того, в противоположность хрупким макропористым неорганическим матрицам (макропористые стекла, кремнеземы, диатомит и др.) криогели ПВС являются нехрупкими вязкоупругими физическими телами, мало подверженными абразивному износу даже при интенсивном перемешивании. Таким образом, криогели ПВС наряду с макропористостью удовлетворяют и требованию операционной стабильности. И, наконец, криогели ПВС могут, в случае необходимости, подвергаться стерилизации, например, промывке дезинфицирующими растворами, облучению или (для уничтожения отработанного материала) автоклавированию.
Способ осуществляют следующим образом: вирусосодержащую жидкость инкубируют с биоаффинным сорбентом, содержащим специфические антитела, иммобилизованные на активированной матрице криогеля ПВС, отмывают несвязавшиеся посторонние компоненты и освобождают адсорбированный вирус из комплекса с биоаффинным сорбентом. Для модификации вируса используют биоаффинный сорбент, содержащий соиммобилизованные специфические антитела и фермент (ферменты), способные вызвать модификацию вирусных частиц. Конкретная реализация предлагаемого изобретения иллюстрируется следующими примерами: Пример 1.
Для концентрирования вируса гриппа (тип A, H1N1, размер вирусных частиц 0,1 мкм) используют биоаффинный сорбент, представляющий собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор 1,0 мкм, активированный глутаровым альдегидом при pH 1,0, к которому ковалентно пришиты специфические антитела, полученные из сыворотки крови кроликов, иммунизированных соответствующим антигеном (емкость сорбента по иммобилизованным антителам 0,7 - 1,2 мг/г). Навеску (0,5 г) биоаффинного сорбента перемешивают с 2,0 мл вирусосодержащей жидкостью в течение 20 часов при +5 o C, затем промывают несвязавшиеся компоненты 0,1М PBS (контроль - нулевые значения оптической плотности при 260 нм и 280 нм, а также отрицательная реакция гемаглютинации (РГА)), и далее проводят десорбцию вируса 0,65 NaCl в 0,05М трис-HCl (pH 7,4) порциями по 1,0 мл в течение трех часов до полного удаления вируса. Емкость биоаффинного сорбента по десорбированному антигену - 1400 ГАЕ/г носителя. (ГАЕ - произведение обратного титра на объем пробы). Специфичность полученного биоафинного сорбента (с иммобилизованными антителами к вирусу гриппа A, H1N1) проверяют с помощью вируса гриппа A, H3N2. Антигенную активность определяют по реакции прямой гемагглютинации (РГА). Полученные результаты показывают, что на данном иммуносорбенте неспецифические антигены (H3N2) не сорбируется, т.е. наблюдается только биоспецифическая сорбция (концентрирование) антигенов.
Для концентрирования вируса гриппа (тип A, H1N1, размер вирусных частиц 0,1 мкм) используют биоаффинный сорбент, представляющий собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор 0,5 мкм, активированный эпихлоргидрином при pH 13, к которому ковалентно пришиты специфические антитела, полученные из сыворотки крови кроликов, иммунизированных соответствующим антигеном (емкость сорбента по иммобилизованным антителам 0,5 - 0,6 мг/г), а элюцию сконцентрированного вируса осуществляют в колоночном режиме с использованием 2,5М MgCl2 в 0,05М трис-HCl (pH 7,4). Количество десорбированного вируса составляет 800 ГАЕ/г носителя.
Для концентрирования вируса гриппа (тип A, H3N2, размер вирусных частиц 0,12 мкм) используют биоаффинный сорбент, представляющий собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор 0,7 мкм, активированный бромцианом при pH 11,5, к которому ковалентно пришиты специфические антитела, полученные из сыворотки крови кроликов, иммунизированных соответствующим антигенам (емкость сорбента по иммобилизованным антителам 1,5 мг/г), а элюцию сконцентрированного вируса проводят с помощью 0,65 М NaCl в 0,5М трис-HCl (pH 7,4). Количество десорбированного вируса составляет 2000 ГАЕ/г носителя.
Для концентрирования вируса парагриппа ГП6 (размер вирусных частиц 0,15 мкм) используют биоаффинный сорбент, представляющий собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор 1,5 мкм, активированный глутаровым альдегидом при pH 0,5, к которому ковалентно пришиты специфические антитела, полученные из сыворотки крови морских свинок, иммунизированных соответствующим антигеном (емкость сорбента по иммобилизованным антителам 0,5 - 0,7 мг/г), а элюцию сконцентрированного вируса проводят с помощью 0,65 NaCl в 0,05М трис-HCl (pH 7,4). Титр очищенного антигена (вирус парагриппа ГП6) определяют методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА). Емкость биоаффинного сорбента в отношении данного вируса составляет 1266 единиц антигенной активности на 1 г носителя.
Для концентрирования вируса оспы (размер вирусных частиц 0,4 х 0,2 мкм) используют биоаффинный сорбент, представляющий собой криогель ПАВ с максимальным диаметром пор до 2 мкм, активированный глутаровым альдегидом при pH 1,2, к которому ковалентно пришиты специфические антитела, полученные из сыворотки крови кроликов, иммунизированных соответствующим антигеном (емкость сорбента по иммобилизованным антителам 0,8 мг/г), а элюцию сконцентрированного вируса проводят с помощью 0,75 NaCl в 0,05 трис-HCl (pH 7,8). Титр очищенного антигена (вирус оспы) определяют в непрямом варианте ИФА. Емкость биоаффинного сорбента в отношении данного вируса составляет 2048 единиц антигенной активности на 1 г носителя.
Для концентрирования и ферментативной модификации вируса ящура (размер вирусных частиц 0,02 мкм) навеску (0,5 г) биоаффинного сорбента, представляющего собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор до 0,04 мкм, активированный глутаровым альдегидом при pH 1,0, к которому ковалентно пришиты специфические антитела к вирусу ящура (получены из сыворотки крови телят, иммунизированных соответствующим антигеном) и модифицирующий фермент - папаин (емкость сорбента по иммобилизованным антителам - 0,4 мг/г, по папаину - 0,2 мг/г) перемешивают с 2,0 мл вирусосодержащей жидкости в течение 12 часов при +5 o C. Аналогичным образом поступают с контрольным биоаффинным сорбентом, у которого иммобилизованный папаин содержит блокированную тиольную группу активного центра. Далее проводят десорбцию вируса 0,5М NaCl в 0,05М трис -HCl (pH 7,4) порциями по 1,0 мл в течение трех часов. Емкость контрольного биоаффинного сорбента по десорбированному вирусу составляет 780 БОЕ/г носителя (БОЕ - бляшкообразующие единицы), носителя с активным папаином - 32 БОЕ/г носителя, т.е. в 24,3 раза меньше, что является результатом действия иммобилизованной протеазы на вирус ящура, сконцентрированный в фазе биоаффинного сорбента за счет взаимодействия с иммобилизованными антителами (факт подобного концентрирования доказывают результаты эксперимента с контрольным биоаффинным сорбентом), что в итоге приводит к значительному снижению вирулентной активности вируса.
Для концентрирования и ферментативной модификации вируса паротита (размер вирусных частиц 0,14 мкм) навеску (0,5 г) биоаффинного сорбента, представляющего собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор до 1,4 мкм, активированный глутаровым альдегидом при pH 1,0, к которому ковалентно пришиты специфические антитела к вирусу паротита (получены из сыворотки крови хомяков, иммунизированных соответствующим антигеном) и модифицирующие ферменты - нейраминидазу и рибонуклеазу (емкость сорбента по иммобилизованным антителам - 0,3 мг/г, по нейраминидазе - 0,15 мг/г, по РНК-азе 0,2 мг/г), инкубируют с 2,0 мл вирусосодержащей жидкости в течение 12 часов при +5 o C. Аналогичным образом поступают с контрольным биоаффинным сорбентом, представляющим собой препарат, в котором иммобилизованы на носителе только антитела, специфические к вирусу паротита (емкость контрольного биоаффинного сорбента по антителам - 0,7 мг/г носителя). Затем отмывают несвязавшиеся компоненты 0,1М PBS (контроль - нулевые значения оптической плотности при 280 и 260 нм) и далее проводят десорбцию вируса 0,5 NaCl в 0,05М трис-HCl (pH 7,4) порциями по 1,0 мл в течение трех часов. Емкость контрольного биоаффинного сорбента по десорбированному вирусу составляет 650 ГАЕ/г носителя, для сорбента с модифицирующими ферментами вирусологической активности не зафиксировано, что связано с действием иммобилизованной нейраминидазы на белковый капсид вируса паротита и последующего воздействия иммобилизованной РНК-азы на освобождающуюся из вириона рибонуклеиновую кислоту, результатом чего является отсутствие вирулентной активности вируса.
Предлагаемый способ концентрирования вируса обладает следующими преимуществами по сравнению с аналогами и прототипом: - повышена эффективность способа, т.к. в противоположность способам-аналогам в заявляемом способе применяется биоаффинный сорбент на основе вязкоупругого нехрупкого и гидролитически стабильного криогеля ПВС, поэтому появляется возможность проводить концентрирование вируса не только в хроматографическом (колоночном) варианте, но и в реакторах с перемешиванием сорбента, что существенно интенсифицирует массообменные процессы, т.е. улучшается технологичность способа; - повышена универсальность способа, т. к. обеспечивается возможность концентрирования, наряду с мелкими, даже самых крупных вирусов (0,5 мкм и более), в то время как в способе-прототипе матрица биоаффинного носителя способна обеспечить диффузию внутрь его гранул лишь довольно мелких (до 0,08 мкм) вирусов; кроме того, универсальность заявляемого способа также обусловлена возможностью одновременного концентрирования и ферментативной модификацией вируса, когда биоаффинный сорбент наряду с иммобилизованными антителами содержит иммобилизованный модифицирующий фермент (ферменты); - биоаффинные сорбенты на основе криогеля ПВС инертны и высокоспецифичны, их можно повторно применять без существенной специфической активности, полимер, используемый для приготовления гелевой основы дешев и доступен.
Литература 1. Х.Френкель-Конрат. Химия и биология вирусов.// М.,1972, стр. 33-37.
2. Я.Туркова, Аффинная хроматография,//М.,1980, стр. 5-14.
3. Purification of measles virus by affinity chromatography and by ultracentrifufation: a comparative study//Njayou M., Quash G.// J. Yirol. Meth. - 1991, v. 32, N 1, p/67-77.
4. Separation and purification of biopolimers by affinity chromatography on controlled-pore silica gel./Colpan M.//Ger. offen. DE 3627063, cl. B 01 D 15/08, 1988.
5. Separation and purification of antigen for diagnosis of infectious bursa disease in chickens. Nagai Sh., Otaki Y., Ueda S., JP 63210775, cl. G 01 N 33/569, 1989.
6. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. Обзор литературных данных. //Лозинский В.И., Вакула А.В., Зубов А.Л.// Биотехнология, N 4, 1992, с. 5-14.
1. Способ концентрирования вируса, включающий его связывание биоаффинным сорбентом, содержащим антитела к вирусу, иммобилизованные на полимерной основе, промывку и последующую десорбцию, отличающийся тем, что в качестве полимерной основы биоаффинного сорбента используют криогель поливинилового спирта с размером пор 0,04 - 2,0 мкм.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что связывание вируса осуществляют с помощью биоаффинного сорбента, содержащего, наряду с антителами, иммобилизованные ферменты, модифицирующие вирус.
Читайте также: