Мр 4 2 0108-16 организация и проведение лабораторной диагностики лихорадки

4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы

Методические рекомендации МР 4.2.0108-16
"Организация и проведение лабораторной диагностики лихорадки денге"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 1 февраля 2016 г.)

1. Область применения

1.1. Методические рекомендации (далее - МР) определяют порядок организации и проведения лабораторной диагностики лихорадки денге (далее - ЛД) и носят рекомендательный характер.

1.2. Настоящие МР предназначены для специалистов лабораторий, осуществляющих диагностические, мониторинговые и научные исследования с возбудителями опасных инфекционных болезней.

2. Нормативные ссылки

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Постановление Правительства Российской Федерации от 15.09.2005 N 569 "О положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации".

3. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.11.2013 N 64 "Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)" (зарегистрировано в Минюсте России 19.05.2014, регистрационный номер 32325).

4. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30.04.2003 N 85 "О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 1.2.1318-03 "Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами" (зарегистрировано в Минюсте России 19.05.2003, регистрационный номер 4558).

5. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.05.2007 N 27 "О реализации Международных медико-санитарных правил (2005)" (зарегистрировано в Минюсте России 31.05.2007, регистрационный номер 9575).

6. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 04.02.2016 N 11 "О представлении внеочередных донесений о чрезвычайных ситуациях санитарно-эпидемиологического характера" (зарегистрировано в Минюсте России 24.03.2016, регистрационный номер 41525).

3. Общие положения

Возбудитель ЛД - вирус денге (Dengue virus), входящий в семейство Flaviviridae, род Flavivirus, серогруппу вируса денге (Dengue Virus group), относится ко II группе патогенности (опасности) по классификации патогенности, действующей на территории Российской Федерации. Существует 4 субтипа вируса денге, различающихся серологически и генетически. Все четыре разновидности вируса денге способны вызвать ЛД, в том числе ее геморрагическую форму. Как правило, эта тяжелая форма возникает при повторном инфицировании другим субтипом вируса.

Ареал ЛД охватывает территории более чем 100 тропических и субтропических стран Африки, Америки, Южной и Юго-Восточной Азии, Океании и Австралии. Имеется информация об эпидемиях и вспышках этого заболевания в южных регионах Европы. В Российской Федерации существует вероятность формирования аутохтонных очагов ЛД на территории Черноморского побережья (Сочи и Сочинский район, Крым).

В последнее время в связи с развитием массового туризма, интенсификацией миграционных процессов и деловых связей возникла проблема завозных случаев этих заболеваний из тропических и субтропических стран в неэндемичные районы. Известны данные об импортированных случаях ЛД в Швеции, Финляндии, других европейских странах, в США, лихорадки Чикунгунья в Японии, Германии, Италии и других государствах Европы, Китае, Израиле, москитной лихорадки Тоскана (эндемичной в Средиземноморском регионе) в США, Германии и Швеции. Имеется информация о завозных случаях других арбовирусных инфекций. В течение шести лет (2009-2014 гг.) сотрудниками Инфекционной больницы N 1 г. Москвы и НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России было диагностировано в общей сложности 178 лабораторно верифицированных случаев лихорадки денге (152), лихорадки Чикунгунья (16), лихорадки Западного Нила (6), москитных лихорадок (3) и японского энцефалита (1) среди лиц, госпитализированных после возвращения из поездок в тропические страны.

По данным Роспотребнадзора, в Российской Федерации наблюдалась следующая динамика регистрации завозных случаев ЛД: в 2012 г. - 63, в 2013 г. - 170, за 8 месяцев 2014 г. - 77, за 10 месяцев 2015 года - 100.

Вирусный геном представлен одноцепочечной РНК положительной полярности длиной около 11 тыс. нуклеотидов. РНК кодирует три структурных (С, prM/M, Е) и семь неструктурных (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) белков.

Основным иммуногенным белком вириона является белок Е, который играет доминирующую роль в генерации нейтрализующих антител и индукции иммунного ответа. На поверхности инфицированных клеток экспрессируется неструктурный гликопротеин NS1, который может секретироваться, инициирует активацию системы комплемента и играет важную роль в развитии шока при геморрагической ЛД.

Инкубационный период ЛД составляет от 2 до 15 дней после укуса инфицированного комара (чаще 5-7 дней), после чего развивается лихорадка, продолжающаяся 6-7 дней и иногда носящая двухфазный характер. Заболевание начинается внезапно с повышения температуры до 39-40°С, появления озноба, болей в костях и мышцах поясничного отдела позвоночника, прямых мышцах живота, крестце, коленных суставах. Отмечается резкая слабость, головная боль, боль в глазных яблоках, светобоязнь, головокружение, потеря аппетита, возможна тошнота и рвота, бессонница, ощущение сухости во рту и сухости губ. У большинства больных увеличиваются периферические лимфатические узлы. Часто появляется экзантема, для которой характерен полиморфизм. Могут быть геморрагические проявления различной степени выраженности (от петехий до органных кровотечений). Лихорадка продолжается 2-7 дней, иногда она носит двухфазный характер и, как правило, заканчивается выздоровлением. Заболевание сопровождается ретроорбитальными болями, миалгией и артралгией. Отмечается покраснение кожи лица и груди с выраженной дерматографией. Примерно в 50% случаев регистрируется макулопапулезная сыпь. В крови регистрируются лейкопения и тромбоцитопения, повышение уровня трансаминаз. По клиническому течению различают 2 формы ЛД: лихорадочную форму (классическую) и геморрагическую (протекает более тяжело, возможно развитие шокового состояния). В Международной классификации болезней 10-го пересмотра классическая ЛД имеет код А90, геморрагическая ЛД - А91.

Особенностью иммунопатогенеза геморрагической ЛД является то, что специфические антитела могут опосредовать феномен антителозависимого усиления инфекции. Антителозависимое усиление включает повышение связывания вируса с клетками, экспрессирующими рецепторы к Fc-фрагментам иммуноглобулинов, после опсонизации антителами. Этот механизм может способствовать утяжелению течения заболевания, часто наблюдаемому при повторном инфицировании гетерологичным вирусом денге.

При геморрагической ЛД летальность достигает 5%, а среди детей - до 15-20%. ЛД является ведущей причиной госпитализации и смерти детей в Юго-Восточной Азии.

У реконвалесцентов, перенесших ЛД, типоспецифический иммунитет сохраняется в течение примерно 2 лет. Перекрестная устойчивость к инфицированию другим типом вируса непродолжительна и редко превышает 12 недель, поэтому уже через 2-3 месяца возможно повторное заболевание за счет заражения гетерологичным типом вируса. В течение жизни человек может последовательно переболеть ЛД, вызванной всеми типами вируса.

4. Методы лабораторной диагностики лихорадки денге

4.1. Для специфической диагностики ЛД используют иммунологические, молекулярно-генетические и вирусологические методы исследований.

4.2. С начала клинических проявлений и до 7 дня болезни вирус денге может быть обнаружен методом ОТ-ПЦР в сгустке крови, цельной крови, сыворотке крови, плазме, а также в аутопсийном материале (печень, легкие, лимфатические узлы, тимус, красный костный мозг). При получении положительного результата ОТ-ПЦР проводят определение нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента к ДНК методом секвенирования.

4.3. Для выделения вируса денге используют новорождённых белых мышей и культуры клеток (Vero, ВНК-21), а также комариные культуры, например, С6/36. Процесс выделения и идентификации вируса денге довольно длительный и проводится в специализированных лабораториях с высоким уровнем защиты (BSL-3). Для выделения вируса используют пробы крови, сыворотки крови, плазмы, обогащенной лейкоцитами, полученные в острый период заболевания (первые 7-10 дней болезни), суспензии органов, взятых при аутопсии.

4.4. Основным методом серодиагностики ЛД является иммуноферментный анализ (ИФА-IgM). Специфические антитела класса IgM выявляются у 50% пациентов, начиная с 3-5-х суток после начала заболевания, а к 10-му дню уже у 99%. Максимальные титры IgM наблюдаются через 2 недели после появления симптомов, постепенное снижение происходит в последующие 2-3 месяца. Возможна циркуляция IgM-антител в крови до полугода. Помимо ИФА-IgM антитела к вирусам денге можно выявлять в сыворотке или плазме больных непрямым методом МФА и методом иммунохроматографии (в сыворотке, плазме или цельной крови). Иммуноглобулины класса G (IgG) в низких титрах обычно обнаруживаются к концу первой недели заболевания, значительно нарастают в последующий период и, вероятно, персистируют в течение всей жизни. Для выявления сероконверсии IgG вторая проба сыворотки обследуется с интервалом в 10-14 дней. Пик IgG-антител приходится на 3-4-ю неделю заболевания, затем их концентрация снижается и остается, как правило, на определяемом уровне в течение длительного времени.

При вторичном инфицировании гетерологичным вирусом денге титры антител нарастают быстрее в основном за счет иммуноглобулинов класса G. Титр IgM во время инфекции, вызванной гетерологичным типом вируса, значительно ниже, чем при первой встрече с возбудителем. Обнаружение IgG-антител имеет значение при ретроспективной диагностике заболевания и дифференциации первичной и вторичной инфекции, вызванной вирусами денге разных типов. Количественное определение IgM и IgG к вирусу денге позволяет определить первичное или вторичное инфицирование, что особенно важно для прогноза исхода заболевания.

4.5. Белок NS1 (NS1-антиген) вируса денге детектируют методом ИФА (в сыворотке крови пациентов и в аутопсийном материале) и методом иммунохроматографии (в сыворотке, плазме, цельной крови) в течение примерно 10 дней с момента появления клинических признаков заболевания, что объясняется высокой концентрацией и продолжительной персистенцией вируса в крови, достигающей инфекционных вирусных частиц на мл. Обнаружение NS1-антигена указывает на присутствие вируса денге в организме больного.

4.6. Другие серологические методы диагностики ЛД, такие как реакция нейтрализации (PH), реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция связывания комплемента (РСК) в настоящее время используются редко. PH хотя и обладает высокой специфичностью (при ее использовании возможна идентификация серотипа вируса денге и дифференциация от других флавивирусных инфекций), однако является трудоемким неэкспрессным методом и может использоваться лишь в специализированной вирусологической лаборатории. РТГА также достаточно специфична, но, как и РСК, обладает низкой чувствительностью. РСК эффективна на поздних этапах заболевания, однако при ее использовании, как и в случае применения ИФА и МФА, возникают сложности по дифференциации ЛД от других родственных флавивирусных инфекций.

4.7. В настоящее время в Российской Федерации для серологической диагностики ЛД используются ИФА- и ПЦР-тест-системы. Перечень наборов реагентов и тест-систем для использования при лабораторной диагностике ЛД приведен в прилож. 4. Импортные наборы для выявления NS1-антигена вируса денге и антител классов IgM и IgG на основе метода иммунохроматографии могут быть скомбинированы в один тест, что удобно в использовании. Однако зарубежные тест-системы для постановки ИФА, МФА и иммунохроматографии пока не нашли применения в диагностических лабораториях России.

4.8. Для постановки точного дифференциального диагноза ЛД серологическое обследование крови больных с подозрением на эту инфекцию необходимо проводить наиболее специфичным методом ИФА-IgM в четырех тест-системах: ИФА-lgМ-денге, ИФА-IgM-лихорадка Западного Нила (ЗН), ИФА-lgМ-желтая лихорадка (ЖЛ), ИФА-lgМ-японский энцефалит (ЯЭ). Эти заболевания имеют часто сходные ареалы распространения, этиологически связаны с родственными флавивирусами, перекрестно реагирующими в серологических реакциях. Кроме того, ЛД целесообразно дифференцировать от близкой по клинической картине лихорадки Чикунгунья, распространенной как и ЛД в Африке, Южной Азии, а в последнее время - в Южной Америке и Европе.

4.9. Лабораторное подтверждение диагноза ЛД основывается на наличии как минимум одного положительного результата на следующие тесты:

- обнаружение РНК вирусов денге методом ОТ-ПЦР;

- наличие NS1-антигена в одном образце сыворотки;

- наличие IgM в одном образце сыворотки;

- нарастание титра IgG в парных сыворотках, взятых с интервалом 2-3 недели, в четыре раза и более.

4.10. Первичное исследование материала от больного осуществляют методами ОТ-ПЦР, ИФА, иммунохимии и иммунохроматографии на базе вирусологических лабораторий, лабораторий особо опасных инфекций в субъектах Российской Федерации, а также, при необходимости, в региональных центрах по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности, в референс-лабораториях.

4.11. В соответствии с приказом Роспотребнадзора от 17.03.2008 N 88 при выявлении положительных результатов первичного обследования пациентов с геморрагическим синдромом, в том числе случаев с летальным исходом, полученный материал отправляется на подтверждающее тестирование в один из Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I-II групп патогенности с прикрепленными субъектами Российской Федерации и Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней, созданных на базе противочумных учреждений, или Национальный центр верификации диагностической деятельности, выполняющий функции Государственной коллекции - ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"*.

5. Правила забора, упаковки и транспортирования клинического (или секционного) материала, порядок проведения исследований и координация деятельности учреждений, осуществляющих диагностику заболеваний, вызванных вирусом денге

5.1. Забор, упаковку и транспортирование материала от пациентов (или умерших) с подозрением на инфекцию, вызванную вирусом денге, осуществляют в строгом соответствии с требованиями санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)", санитарных правил СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности" и методических указаний МУ 3.4.2552-09 "Организация и проведение первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения".

Забор, упаковку проводят в медицинских организациях. Забор материала от больных производится медицинскими работниками стационара, в который госпитализирован больной, под руководством специалиста Роспотребнадзора, подготовленного по вопросам диагностики особо опасных инфекционных болезней и биологической безопасности при работе с клиническим материалом, подозрительным на заражение возбудителями инфекционных болезней I-II групп патогенности. В случае невозможности быстрого прибытия указанных специалистов забор материала от больного осуществляют два медицинских работника, один из которых должен быть подготовлен по биологической безопасности при работе с клиническим материалом, подозрительным на заражение возбудителями инфекционных болезней I-II групп патогенности.

Секционный материал отбирают медицинские работники патолого-анатомических отделений (бюро судебно-медицинской экспертизы) в присутствии специалиста по особо опасным инфекциям. Забор материала производят в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры стерильными инструментами. Способы взятия, условия хранения и транспортирования клинического материала для лабораторной диагностики ЛД приведены в прилож. 1.

5.2. При подозрении на ЛД от больных для исследования берут кровь. Для серологических исследований, основанных на выявлении нарастания титра антител в парных сыворотках, образцы крови забирают в острую стадию заболевания, а затем через 2-3 недели. В случае летального исхода исследуют секционный материал (кровь из сердца, кусочки печени, селезенки, легких, лимфатических узлов, тимуса, красного костного мозга).

5.3. Оптимальные сроки детекции вируса денге и его маркеров в клиническом материале представлены в прилож. 2.

5.4. Отправку секционного материала в лабораторию рекомендуется осуществлять в транспортной таре со стабилизирующей средой (прилож. 3).

5.5. Первичное исследование материала от больного осуществляют методами ОТ-ПЦР, ИФА, НРИФ, иммунохроматографическим методом, а также выделяя вирус на чувствительной биологической модели (при наличии разрешения на проведение работ с вирусом денге). В случае получения положительного результата ОТ-ПЦР, при наличии соответствующего оснащения лаборатории, проводят определение нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента к ДНК методом секвенирования. Для секвенирования фрагментов генома и генотипирования вируса денге возможно использование протокола, приведенного в прилож. 5.

5.6. Используемые на этапах первичного исследования материала от больного тест-системы и наборы реагентов должны быть разрешены к применению в Российской Федерации в установленном порядке.

5.7. Результаты исследований направляют в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, в управление Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации и в учреждение, направившее материал.

[youtube.player]

реакция связывания комплемента

реакция торможения гемагглютинации

1. Область применения

1.1. Методические рекомендации (далее - MP) определяют порядок организации и проведения лабораторной диагностики лихорадки денге (далее - ЛД) и носят рекомендательный характер.

1.2. Настоящие MP предназначены для специалистов лабораторий, осуществляющих диагностические, мониторинговые и научные исследования с возбудителями опасных инфекционных болезней.

2. Нормативные ссылки

3. Общие положения

Лихорадка денге относится к острым природно-очаговым арбовирусным инфекционным заболеваниям с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя, характеризующимся лихорадкой, общей интоксикацией, миалгией, артралгией, лимфоаденопатией, экзантемой, иногда геморрагическим синдромом.

Возбудитель ЛД - вирус денге (Dengue virus), входящий в семейство Flaviviridae, род Flavivirus, серогруппу вируса денге (Dengue virus group), относится ко II группе патогенности (опасности) по классификации патогенности, действующей на территории Российской Федерации. Существует 4 субтипа вируса денге, различающихся серологически и генетически. Все четыре разновидности вируса денге способны вызвать ЛД, в том числе ее геморрагическую форму. Как правило, эта тяжелая форма возникает при повторном инфицировании другим субтипом вируса.

Ареал ЛД охватывает территории более чем 100 тропических и субтропических стран Африки, Америки, Южной и Юго-Восточной Азии, Океании и Австралии. Имеется информация об эпидемиях и вспышках этого заболевания в южных регионах Европы. В Российской Федерации существует вероятность формирования аутохтонных очагов ЛД на территории Черноморского побережья (Сочи и Сочинский район, Крым).

В последнее время в связи с развитием массового туризма, интенсификацией миграционных процессов и деловых связей возникла проблема завозных случаев этих заболеваний из тропических и субтропических стран в неэндемичные районы. Известны данные об импортированных случаях ЛД в Швеции, Финляндии, других европейских странах, в США, лихорадки Чикунгунья в Японии, Германии, Италии и других государствах Европы, Китае, Израиле, москитной лихорадки Тоскана (эндемичной в Средиземноморском регионе) в США, Германии и Швеции. Имеется информация о завозных случаях других арбовирусных инфекций. В течение шести лет (2009-2014 гг.) сотрудниками Инфекционной больницы N 1 г. Москвы и НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского Минздрава России было диагностировано в общей сложности 178 лабораторно верифицированных случаев: лихорадки денге (152), лихорадки Чикунгунья (16), лихорадки Западного Нила (6), москитных лихорадок (3) и японского энцефалита (1) среди лиц, госпитализированных после возвращения из поездок в тропические страны.

По данным Роспотребнадзора в Российской Федерации наблюдалась следующая динамика регистрации завозных случаев ЛД: в 2012 г. - 63, в 2013 г. - 170, за 8 месяцев 2014 г. - 77, за 10 месяцев 2015 года - 100.

В эндемичных странах мира ежегодно регистрируются до 100 млн случаев ЛД в классической форме и примерно 500000 в виде геморрагической лихорадки, летальность при которой достигает 15-20%. Источником инфекции являются больные люди, обезьяны, возможно летучие мыши. Известны 2 эпидемиологические формы ЛД: джунглевая и городская. Переносчиками вируса при джунглевой форме являются комары Aedes niveus (нападающие как на обезьян, так и на людей), при городской эпидемиологической форме лихорадки - синантропные комары преимущественно Aedes aegypti и Aedes albopictus. Вирус способен размножаться в комарах при температуре воздуха не ниже 22°С.

Вирусный геном представлен одноцепочечной РНК положительной полярности длиной около 11 тыс. нуклеотидов. РНК кодирует три структурных (С, prM/М, Е) и семь неструктурных (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) белков.

Основным иммуногенным белком вириона является белок Е, который играет доминирующую роль в генерации нейтрализующих антител и индукции иммунного ответа. На поверхности инфицированных клеток экспрессируется неструктурный гликопротеин NS1, который может секретироваться, инициирует активацию системы комплемента и играет важную роль в развитии шока при геморрагической ЛД.

Инкубационный период ЛД составляет от 2 до 15 дней после укуса инфицированного комара (чаще 5-7 дней), после чего развивается лихорадка, продолжающаяся 6-7 дней и иногда носящая двухфазный характер. Заболевание начинается внезапно с повышения температуры до 39-40°С, появления озноба, болей в костях и мышцах поясничного отдела позвоночника, прямых мышцах живота, крестце, коленных суставах. Отмечается резкая слабость, головная боль, боли в глазных яблоках, светобоязнь, головокружение, потеря аппетита, возможна тошнота и рвота, бессонница, ощущение сухости во рту и сухости губ. У большинства больных увеличиваются периферические лимфатические узлы. Часто появляется экзантема, для которой характерен полиморфизм. Могут быть геморрагические проявления различной степени выраженности (от петехий до органных кровотечений). Лихорадка продолжается 2-7 дней, иногда она носит двухфазный характер и, как правило, закачивается выздоровлением. Заболевание сопровождается ретроорбитальными болями, миалгией и артралгией. Отмечается покраснение кожи лица и груди с выраженной дерматографией. Примерно в 50% случаев регистрируется макулопапулезная сыпь. В крови регистрируется лейкопения и тромбоцитопения, повышение уровня трансаминаз. По клиническому течению различают 2 формы ЛД: лихорадочную форму (классическую) и геморрагическую (протекает более тяжело, возможно развитие шокового состояния). В Международной классификации болезней 10-го пересмотра классическая ЛД имеет код А90, геморрагическая ЛД - А91.

Особенностью иммунопатогенеза геморрагической ЛД является то, что специфические антитела могут опосредовать феномен антителозависимого усиления инфекции. Антителозависимое усиление включает повышение связывания вируса с клетками, экспрессирующими рецепторы к Fc фрагментам иммуноглобулинов, после опсонизации антителами. Этот механизм может способствовать утяжелению течения заболевания, часто наблюдаемому при повторном инфицировании гетерологичным вирусом денге.

При геморрагической ЛД летальность достигает 5%, а среди детей - до 15-20%. ЛД является ведущей причиной госпитализации и смерти детей в Юго-Восточной Азии.

У реконвалесцентов, перенесших ЛД, типоспецифический иммунитет сохраняется в течение примерно 2 лет. Перекрестная устойчивость к инфицированию другим типом вируса непродолжительна и редко превышает 12 недель, поэтому уже через 2-3 месяца возможно повторное заболевание за счет заражения гетерологичным типом вируса. В течение жизни человек может последовательно переболеть ЛД, вызванной всеми типами вируса.

4. Методы лабораторной диагностики лихорадки денге

4.1 Для специфической диагностики ЛД используют иммунологические, молекулярно-генетические и вирусологические методы исследований.

4.2 С начала клинических проявлений и до 7 дня болезни вирус денге может быть обнаружен методом ОТ-ПЦР в сгустке крови, цельной крови, сыворотке крови, плазме, а также в аутопсийном материале (печень, легкие, лимфатические узлы, тимус, красный костный мозг). Список коммерческих наборов для проведения ОТ-ПЦР приведен в прилож.4. При получении положительного результата ОТ-ПЦР проводят определение нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента к ДНК методом секвенирования.

4.3 Для выделения вируса денге используют новорождённых белых мышей и культуры клеток (Vero, ВНК-21), а также комариные культуры, например, С6/36. Процесс выделения и идентификации вируса денге довольно длительный и проводится в специализированных лабораториях с высоким уровнем защиты (BSL-3). Для выделения вируса используют пробы крови, сыворотки крови, плазмы, обогащенной лейкоцитами, полученные в острый период заболевания (первые 7-10 дней болезни), суспензии органов, взятых при аутопсии.

4.4 Основным методом серодиагностики ЛД является иммуноферментный анализ (ИФА-lgM). Специфические антитела класса IgM выявляются у 50% пациентов, начиная с 3-5 суток после начала заболевания, а к 10 дню уже у 99%. Максимальные титры IgM наблюдаются через 2 недели после появления симптомов, постепенное снижение происходит в последующие 2-3 месяца. Возможна циркуляция IgM-антител в крови до полугода. Помимо ИФА-lgM антитела к вирусам денге можно выявлять в сыворотке или плазме больных непрямым методом МФА и методом иммунохроматографии (в сыворотке, плазме или цельной крови). Иммуноглобулины класса G (IgG) в низких титрах обычно обнаруживаются к концу первой недели заболевания, значительно нарастают в последующий период и, вероятно, персистируют в течение всей жизни. Для выявления сероконверсии IgG вторая проба сыворотки обследуется с интервалом в 10-14 дней. Пик IgG антител приходится на 3-4 неделю заболевания, затем их концентрация снижается и остается, как правило, на определяемом уровне в течение длительного времени.

При вторичном инфицировании гетерологичным вирусом денге титры антител нарастают быстрее в основном за счет иммуноглобулинов класса G. Титр IgM во время инфекции, вызванной гетерологичным типом вируса, значительно ниже, чем при первой встрече с возбудителем. Обнаружение IgG-антител имеет значение при ретроспективной диагностике заболевания и дифференциации первичной и вторичной инфекции, вызванной вирусами денге разных типов. Количественное определение IgM и IgG к вирусу денге позволяет определить первичное или вторичное инфицирование, что особенно важно для прогноза исхода заболевания.

4.5. Белок NS1 (NS1-антиген) вируса денге детектируют методом ИФА (в сыворотке крови пациентов и в аутопсийном материале) и методом иммунохроматографии (в сыворотке, плазме, цельной крови) в течение примерно 10 дней с момента появления клинических признаков заболевания, что объясняется высокой концентрацией и продолжительной персистенцией вируса в крови, достигающей 10 -10 инфекционных вирусных частиц на мл. Обнаружение NS1-антигена указывает на присутствие вируса денге в организме больного.

4.6 Другие серологические методы диагностики ЛД, такие как реакция нейтрализации (РН), реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция связывания комплемента (РСК) в настоящее время используются редко. РН хотя и обладает высокой специфичностью (при ее использовании возможна идентификация серотипа вируса денге и дифференциация от других флавивирусных инфекций), однако является трудоемким неэкспрессным методом и может использоваться лишь в специализированной вирусологической лаборатории. РТГА также достаточно специфична, но, как и РСК, обладает низкой чувствительностью. РСК эффективна на поздних этапах заболевания, однако при ее использовании, как и в случае применения ИФА и МФА, возникают сложности по дифференциации ЛД от других родственных флавивирусных инфекций.

4.7 В настоящее время в Российской Федерации для серологической диагностики ЛД используются ИФА- и ПЦР-тест-системы. Перечень наборов реагентов и тест-систем для использования при лабораторной диагностике ЛД приведен в прилож.4. Импортные наборы для выявления NS1-антигена вируса денге и антител классов IgM и IgG на основе метода иммунохроматографии могут быть скомбинированы в один тест, что удобно в использовании. Однако зарубежные тест-системы для постановки ИФА, МФА и иммунохроматографии пока не нашли применения в диагностических лабораториях России.

4.8 Для постановки точного дифференциального диагноза ЛД серологическое обследование крови больных с подозрением на эту инфекцию необходимо проводить наиболее специфичным методом ИФА-IgM в четырех тест-системах: ИФА-IgM-денге, ИФА-IgМ-лихорадка Западного Нила (ЗН), ИФА-IgM-желтая лихорадка (ЖЛ), ИФА-IgМ-японский энцефалит (ЯЭ). Эти заболевания имеют часто сходные ареалы распространения, этиологически связаны с родственными флавивирусами, перекрестно реагирующими в серологических реакциях. Кроме того, ЛД целесообразно дифференцировать от близкой по клинической картине лихорадки Чикунгунья, распространенной как и ЛД в Африке, Южной Азии, а в последнее время - в Южной Америке и Европе.

4.9 Лабораторное подтверждение диагноза ЛД основывается на наличии как минимум одного положительного результата на следующие тесты:

обнаружение РНК вирусов денге методом ОТ-ПЦР;

наличие NS1-антигена в одном образце сыворотки;

наличие IgM в одном образце сыворотки;

нарастание титра IgG в парных сыворотках, взятых с интервалом 2-3 недели, в четыре раза и более.

[youtube.player]

Читайте также: