Встречаемость различных генотипов хеликобактера статьи
Большое значение имеет проведение генотипирования НР и исследование взаимосвязи генотипов с различными клинико-морфологическими изменени-ями СОЖ. С помощью метода ПЦР мы провели генотипирование 143 НР-позитивных детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями (рис.1). Среди обследованных детей выявились следующие генотипы vacAs1 (1), vacAs2 (2), cagAvacAs1 (3), cagAcagH (4), cagA (5), cagAcagHvacAs1 (6), cagAcagHvacAs2 (7), cagAvacAs2 (8), cagHvacAs1 (9), cagHvacAs2 (10). Для определения значимости различных генотипов хеликобактера в развитии пато-логических изменений в слизистой оболочке желудка большое значение имеет частота их встречаемости у детей. Из диаграммы отчетливо видно преобладание у детей генотипа cagAcagHvacAs1 (6). Было важно установить взаимосвязь определенного генотипа с эндоскопическими, морфологическими изменениями и выявить существование специфических генотипов для развития определенных заболеваний верхних отделов ЖКТ в детском возрасте. Анализ эндоскопических изменений СОЖ у детей с различными генотипами показал, что при поверхностных поражениях слизистой оболочки наблюдались все десять генотипов (рис.1). Преобладали 1 (vacAs1) и 2 (vacAs2) генотипы, в то время, как при нодулярных изменениях, достоверно чаще обнаруживались генотипы cagAcagHvacAs1 (6) и cagAcagHvacAs2 (7) (29% и 16% соответственно), наряду с остальными генотипами (рис.2).
Рис.1. Частота встречаемости различных генотипов у обследованных детей.
У детей с эрозивным хроническим гастродуоденитом количество определяемых генотипов НР было меньшим (6), достоверно чаще мы также наблюдали 6 генотип (cagAcagHvacAs1) (рис.3). При язвенных дефектах наблюдалось всего два генотипа НР, и генотип cagAcagHvacAs1 (6) встречался также достоверно чаще (рис. 4).
Таким образом, данное исследование показало, что при генотипе cagAcagHvacAs1 достоверно чаще встречаются нодулярные, а также эрозивно-язвенные дефекты СОЖ, что позволяет говорить о специфичности данного ге-нотипа для развития определенных изменений в слизистой оболочке желудка, а, следовательно, и для развития определенных гастродуоденальных заболеваний в детском возрасте.
Рис.2 Частота встречаемости генотипов при нодулярном гастродуодените.
При анализе морфологических изменений у НР(+) детей выявлена взаи-мосвязь степени выраженности воспаления и активности процесса с определенными генотипами НР. При поверхностных повреждениях слизистой оболочки воспаление и активность были слабо выражены. При нодулярных изменениях чаще наблюдались более выраженные воспаление (43%) и активность (63%) процесса. У детей с эрозивными изменениями СОЖ высокая степень воспаления и активности процесса наблюдались у 65% и у 95% больных соответственно.
Рис.3 Частота встречаемости генотипов при эрозивном гастродуодените
Рис.4. Частота встречаемости генотипов при ЯБДК.
При язвообразовании воспаление и активность процесса, соответствующие значительно выраженным, были обнаружены у 60 и 90% детей. Следовательно, у пациентов с нодулярными, эрозивно-язвенными изменениями СОЖ досто-верно чаще имеют место выраженные морфологические изменения, что подтверждает литературные данные (Нургалиева Б.К., 2004).
Известно, что НР может быть выявлен не только из антрального отдела, но и из тела желудка. При этом выявляются неодинаковые генотипы хелико-бактера (Russmann H., Kempf V.A., 2001). Это может стать причиной неудач-ных попыток лечения НР у детей с хронической гастродуоденальной патоло-гией. Поэтому в данном исследовании мы проводили определение Нelicobacter Pylori не только в антральном отделе, но и в теле желудка. Получены положи-тельные результаты определения НР в теле желудка у 80% пациентов. При ис-пользовании метода ПЦР, появилась возможность сравнить генотипы, выде-ляемые из антрального отдела и тела желудка. У 12% детей из числа обследо-ванных, мы обнаружили одновременное выделение двух генотипов хели-кобактера, что свидетельствует о нахождении в СОЖ более одного штамма НР. Таким образом, учитывая полученные данные, необходимо при обследовании больных проводить определение НР и в антральном отделе, и в теле желудка. С одной стороны, одновременная контаминация СОЖ более чем одним штаммом НР может явиться причиной неудачной терапии, а также реинфицирования. С другой стороны, до сих пор неизвестно, может ли инфекция смешанной культурой хе-ликобактера увеличить риск серьезных клинических проявлений, таких как язва или рак желудка. Остается также открытым вопрос о подходе к лечению таких пациентов (Корсунский А.А., П.Л. Щербаков, 2003).
В настоящее время активно ведется поиск неинвазивных методов диаг-ностики НР. У взрослых пациентов метод ПЦР проводится в зубном налете, копрофильтрате. Мы проводили выявление НР у детей с хроническими заболеваниями верхних отделов ЖКТ в таких же субстратах, как зубной налет и копрофильтрат. С помощью метода ПЦР хеликобактер в зубном налете детей с гастродуоденальными заболеваниями определялся в 27,9% случаев. Учитывая разное количество зубного налета в различные возрастные периоды, мы пытались найти различия в частоте обнаружения НР в зубном налете в зависимости от возраста. Наблюдалась тенденция к увеличению частоты обнаружения НР у детей старше 10 лет, но результаты оказались недосто-верными. Частота совпадения результатов выявления НР из биоптатов антраль-ного отдела желудка и из зубного налета составила 43,2%. Подобные результаты проведения ПЦР по выявлению НР в зубном налете, которые наблюдаются во многих исследовательских работах, на настоящий момент рассматривается скорее, как аргумент в пользу несостоятельности попыток выявления НР из ротовой полости, чем в пользу того, что сама ротовая полость является резервуаром этого микроорганизма (Gerguson D., 1993). В копро-фильтрате методом ПЦР хеликобактер определялся также у небольшого коли-чества детей - 27,3%. Частота совпадений результатов определения НР в биоп-татах антрального отдела и копрофильтрата составила 43,8%. Возможно этот факт объясняется тем, что при пассаже по кишечнику НР превращается в кокковидную форму или погибает, начинает выделять другие антигены (Suzuki N.,2002). В результате он не обнаруживается стандартным набором праймеров. Следовательно, из-за низкой чувствительности метода ПЦР в зубном налете и копрофильтрате не представляется возможным на настоящий момент пользоваться данными субстратами для выявления инфицированности НР, а также для контроля за эффективностью эрадикации.
С целью выявления семейной инфицированности и ее значения в развитии заболеваний было обследовано 128 родителей из семей больных детей. Исследования показали, что хеликобактер был обнаружен у 78% родителей, причем чаще у одного (91%) родителя и только в 9% случаев – у двух роди-телей. Особого интереса заслуживают данные, полученные при анализе НР- статуса детей в таких семьях (рис.5). У НР-негативных родителей частота выявления НР-положительных детей составила 50%. При инфицировании хеликобактером одного из родителей, частота выявления НР-позитивных детей составила 90%. В семьях, где были инфицированы оба родителя, по нашим данным все дети также были НР инфицированы. Следовательно, при выделении хеликобактера от обоих родителей, по данным нашего исследования, дети будут всегда инфицированы. Таким образом, подтверждаются литературные данные о значении внутрисемейного пути передачи НР-инфекции (Щербаков П.Л., 2006).
Рис.5 Частота инфицирования НР в семьях обследованных детей.
Современные международные рекомендации предусматривают проведение медикаментозной терапии НР-инфекции по схемам, содержащим ингибитор протонной помпы и два антибактериальных препарата, направленных на эрадикацию хеликобактера. В связи с частым выбором кларитромицина, как антибиотика 1-й линии терапии НР инфекции, представляло интерес проана-лизировать чувствительность выделенных штаммов хеликобактера к этому антибиотику. Использование метода ПЦР в сочетании с рестрикционным анализом (ПДРФ) дает возможность эффективно выявлять точковые мутации в гене 23 рРНК и может служить надежным инструментом определения устой-чивых к кларитромицину штаммов, что позволит выбрать средство для эради-кационной терапии более эффективно. Были обследованы 45 пациентов с целью выявления мутаций в гене 23 рРНК. В нашем исследовании у 10 детей были обнаружены штаммы НР, устойчивые к кларитромицину, что составило 22% (таблица 7).
Использование кларитромицина в терапии 1-й линии, согласно 3–ему Маастрихтскому соглашению, имеет смысл только в том случае, если первичная устойчивость к этому антибиотику составляет менее 15-20%.
Определение чувствительности штаммов НР к кларитромицину.
480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников
Автореферат - бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников
Абузарова Эльмира Ренардовна. Особенности генотипов Helicobacter pylori и полиморфных локусов генов цитокинов (IL-1 и IL-10) у больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки : диссертация . кандидата биологических наук : 03.00.04 / Абузарова Эльмира Ренардовна; [Место защиты: Казан. гос. ун-т им. В.И. Ульянова-Ленина].- Казань, 2008.- 168 с.: ил. РГБ ОД, 61 08-3/790
Содержание к диссертации
Глава 1. Общая характеристика хеликобактерий 14
1.1. История открытия, систематика и филогения Helicobacter pylori 14
1.2. Особенности клеточной и молекулярной биологии Helicobacter pylori 18
1.3. Факторы вирулентности и генетический полиморфизм штаммов Helicobacter pylori 29
Глава 2. Феноменология язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter pylori 37
2.1. Особенности микробиоценозов желудка у больных язвенной болезнью 37
2.2. Особенности индуцированных Helicobacter pylori поражений слизистой оболочки желудка у больных язвенной болезнью: патофизиологические, цитологические и ультраструктурные аспекты 43
2.4. Контроль инфекций Helicobacter pylori: проблемы и перспективы 57
Экспериментальная часть 61
Глава 3. Материалы и методы 61
3.1. Особенности клинического материала 61
Выделение и очистка ДНК из проб 61
Выделение ДНК из крови 62
Выявление Helicobacter pylori в клиническом материале методом ПЦР 63
Выявление генов патогенности клинических изолятов Helicobacter pylori методом ПЦР 64
Выявление полиморфных вариантов генов IL-1 и IL- 10 65
Выявление Mycoplasma hyorhinis в клиническом материале методом ПЦР 67
Определение нуклеотидных последовательностей 67
Электронно-микроскопическое исследование образцов слизистой оболочки желудка больных язвенной болезнью 68
Статистическая обработка данных 68
Результаты исследований и их обсуждение 70
Частота встречаемости Helicobacter pylori и генотипы штаммов хеликобактера у больных язвенной болезнью 70
Распределение генотипов IL-1 и IL-10 у больных язвенной болезнью и представителей контрольной группы 80
Ассоциация генотипов H.pylori с полиморфными вариантами генов цитокинов IL-1 и IL-10 у больных язвенной болезнью 92
Частота встречаемости Mycoplasma hyorhinis в биоптатах больных язвенной болезнью и особенности генотипов H.pylori и полиморфных локусов генов цитокинов (IL-1 и IL-10) в случае сочетанной (Hpyhri+M. hyorhinis) инфекции 95
4.5. Особенности ультраструктуры эпителия слизистой желудка у больных язвенной болезнью желудка с разными генотипами H.pylori и полиморфных локусов генов цитокинов (IL-1 и IL-10) при наличии и отсутствии сочетанной (H.pylori+M. hyorhinis) инфекции 101
4.6. Особенности морфометрических показателей язв у больных с различными генотипами полиморфных локусов генов цитокинов Список литературы 124 Введение к работе Актуальность проблемы. Helicobacter pylori является одной из наиболее изучаемых бактерий в мире в настоящее время. Носителем H.pylori является почти каждый второй житель планеты. Инфицирование возможно как непосредственно от человека или животных, так и опосредованно, в том числе через эндоскопические аппараты и стоматологические инструменты [Fontham, 1995; Feldman, 1998; De Schryver et al., 2001]. Для большинства инфицированных характерно бессимптомное носительство. Вместе с тем предполагается наличие взаимосвязи между инфекцией H.pylori и рядом заболеваний у человека [Bohr et al., 2007]. Однако пока доказана связь инфицирования слизистой оболочки желудка (СОЖ) человека H.pylori с гастродуоденальной патологией – В-клеточной лимфомой, хроническим гастритом, а также язвенной болезнью (ЯБ) желудка и двенадцатиперстной кишки [Van Doorn et al., 1998] – одним из наиболее распространенных заболеваний желудочно-кишечного тракта у человека [Ивашкин и др., 2003; Григорьев, Яковенко, 2004]. Основным документом, определяющим показания и подходы к лечению язвенной болезни желудка (ЯБЖ) и двенадцатиперстной кишки (ЯБДК), ассоциированной с H.pylori, является Маастрихтский консенсус II и III [Malfertheiner et al., 2002, 2005]. Однако в большинстве случаев результат применения соответствующих схем лечения не достигает необходимых 80% [Malfertheiner et al., 2005]. Основными причинами недостаточной эффективности предлагаемых методов лечения считают неизученность молекулярно-генетических аспектов заболевания ЯБ, ассоциированной с H.pylori, в том числе молекулярно-генетических основ восприимчивости и чувствительности к персистенции H.pylori у разных индивидов [Ando et al., 2007], а также отсутствие учета региональных особенностей хеликобактерных инфекций [Абдулхаков, 2006]. Различия восприимчивости и чувствительности к персистенции H.pylori связывают с вариабельностью генотипов хеликобактера в отношении факторов вирулентности, а также полиморфизмом генов иммунного ответа у носителей инфекционных агентов. Предполагают, что развитие ЯБЖ и ЯБДК может быть ассоциировано с наличием у индивидов определенных генотипов хеликобактера (cagA, iceA, babA и vacA), а также вариантов полиморфных локусов генов ключевых иммуномедиаторов про- и противовоспалительных реакций – IL-1 (IL-1B-511C>T, IL-1B+3954C>T, IL-1RN(VNTR)) и IL-10 (IL-10-1082G>A) [Garcia-Gonzalez et al., 2001, 2003; Rad et al., 2003, 2004]. Предполагается, что носители определенных генотипов полиморфных локусов генов цитокинов (IL-1 и IL-10) могут колонизироваться специфичными в отношении факторов вирулентности штаммами H.pylori, а распределение генотипов H.pylori и полиморфных локусов генов цитокинов, а также их ассоциации у индивидов в разных регионах различаться [Garcia-Gonzalez et al., 2003; Rad et al., 2004]. В последнее время появились сообщения, что существенным фактором развития гастродуоденальной патологии может быть колонизация СОЖ микоплазмами, в частности, Mycoplasma hyorhinis [Huang et al., 2001; Kwon et al., 2004]. Однако систематические исследования для проверки всех вышеуказанных предположений в разных регионах мира не проводились. Цель данной работы - определить особенности генотипов H.pylori и полиморфных локусов генов цитокинов (IL-1 и IL-10) у больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки в г. Казани. Основные задачи исследования: 1. Протестировать биоптаты больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки на наличие Helicobacter pylori и определить частоту встречаемости бактерий в исследуемых образцах. 2. Выполнить типирование штаммов H.pylori по генам факторов вирулентности (cagA, iceA, babA и аллелям m1, m2, s1, s2 гена vacA) у больных язвенной болезнью и провести анализ распределения генотипов H.pylori в обследуемой группе. 3. Определить варианты полиморфных локусов генов IL-1B (IL-1B-511C>T, IL-1B+3954C>T, IL-1RN(VNTR)) и IL-10 (IL-10-1082G>A) у больных язвенной болезнью, а также в контрольной группе и провести анализ распределения частоты их встречаемости в обследуемых группах. *Импакт фактор за 2018 г. по данным РИНЦ Журнал входит в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК. Читайте в новом номере Helicobacter pylori является одним из самых распространенных глобальных патогенов. У многих инфицированных людей хеликобактерная инфекция приводит к болезням верхнего отдела ЖКТ, включая язвенную болезнь и рак желудка. Ключевые слова: Helicobacter pylori, антибиотик, устойчивость, распространенность, лечение, стратегия терапии. Для цитирования: Ахметова Д.Г., Балтабекова А.Ж., Шустов А.В. Устойчивость к антибиотикам Helicobacter pylori: обзор эпидемиологических тенденций и проблемы терапии. РМЖ. Медицинское обозрение. 2018;7(I):13-18. Antibiotic resistance of Helicobacter pylori: review of epidemiological trends and problems of treatment 1 Republican Diagnostic Center, Astana Helicobacter pylori (HP) is one of the most common global pathogens. Helicobacter infection leads in many infected people to development of upper GI tract diseases, including peptic ulcers and gastric cancer. Key words: helicobacter pylori, antibiotic, resistance, prevalence, treatment, therapeutic strategies. В статье представлены обзор эпидемиологических тенденций и проблемы терапии устойчивости к антибиотикам Helicobacter pylori Распространенность антибиотикорезистентности H. py-lori разнится по географическим районам [15]. Распространенность хеликобактерной инфекции в США не изменилась с 2000 по 2010 г., но частота успешной эрадикации инфекции снизилась в этот период [1, 6, 13, 16]. 20%) с 1995 г. Распространенность кларитромицин-резистентных штаммов в этой стране также остается низкой (менее 5%). Напротив, страны с высокой встречаемостью серологических маркеров H. pylori сталкиваются с ростом устойчивости возбудителя Только для зарегистрированных пользователей В статье представлены результаты бактериологического тестирования 48 штаммов Helicobacter pylori (H. pylori), выделенных от пациентов в Санкт-Петербурге. Антибиотикорезистентность штаммов H. pylori оценивали методом серийных разведений. Среди анализируемы The article describes the results of bacteriologic testing of 48 Helicobacter pylori (H. pylori) strains taken from the patients in Saint-Petersburg. Antibiotic resistance of H. pylori strains was evaluated by serial breeding method. Among the analysed isolates, 42,5% were resistant to metronidazole, 27,1% — to levofloxacin, 25% — to clarithromycin, 6,3% — to amoxicillin. All the tested strains were sensitive to tetracycline. Эрадикация H. pylori у инфицированных пациентов, страдающих хроническим гастритом, язвенной болезнью, функциональной диспепсией и другими H. pylori-ассоциированными заболеваниями, является основной стратегией предотвращения развития некардиального рака желудка [1]. В любой клинической ситуации, при которой врач сомневается в необходимости диагностировать инфекцию H. pylori и провести уничтожение микроорганизма, дополнительным и крайне актуальным аргументом в пользу этих мероприятий должен стать профилактический эффект эрадикации относительно возникновения рака желудка, особенно у пациентов с отягощенным наследственным анамнезом [2]. Целью данной работы было получение данных о состоянии первичной антибиотикорезистентности штаммов H. pylori, выделенных от пациентов в Санкт-Петербурге. Исследование по протоколу SHELF проводилось в Санкт-Петербурге с мая 2013 по июнь 2014 года. Одобрение было получено в центральном и локальном научном этическом комитете в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. В исследовании использовались гастробиоптаты пациентов, соответствующих следующим критериям. Критерии исключения: 1) пациенты, ранее получавшие антимикробную терапию для эрадикации H. pylori; Критерии включения: 1) мужчины и женщины в возрасте от 18 до 65 лет; В качестве основы питательной среды для выделения и культивирования H. pylori использовался колумбийский агар. Каждый образец биопсии высевался параллельно на две чашки Петри с агаром, содержащим антибиотики в следующих концентрациях: ванкомицин в концентрации 6 мкг/мл, триметоприм, в концентрации 2 мкг/мл (растворяли в спирте) и амфотерицин В (или налидиксовую кислоту) в концентрации 2–10 мкг/мл. Инкубация посевов осуществлялась в микроаэрофильных условиях при содержании кислорода около 5%. Для этих целей использовались анаэростаты системы GasPac100 c газогенерирующими пакетами типа GasPak (BBL CampyPak Plus Microaerophilic System envelopes with Palladium Catalyst). На кровяной питательной среде на 5–7 сутки H. pylori формировал мелкие, круглые, гладкие, прозрачные, влажные колонии диаметром около 1 мм. Колонии H. pylori, полученные в результате первичного посева биопсийного материала, использовали для приготовления мазков, окраски их по Граму и постановки уреазного теста. Решение вопроса о принадлежности выделенной культуры к роду Helicobacter выносили на основании характерной морфологии выделенных колоний, а также набора тестов: морфологии культуры в мазке, окрашенном по Граму, и наличии характерных биохимических свойств (способности к продукции уреазы). Типичные клетки H. pylori при микроскопии имели вид тонких изогнутых нежно-розовых палочек. Антибиотикорезистентность выделенных штаммов H. pylori изучали, используя метод серийных разведений, который основан на регистрации ингибиции роста микроорганизма на питательном агаре, содержащем определенные концентрации антибиотика. Определяли чувствительность штаммов H. pylori к кларитромицину, амоксициллину, левофлоксацину, метронидазолу и тетрациклину. Рабочие концентрации исследуемых антибактериальных препаратах в агаре были следующими:
Распространенность резистентности H. pylori к антибиотикам зависит от географического региона и, по имеющимся данным, растет во многих странах мира. Эффективность лечения хеликобактерной инфекции снижается во всех регионах, по которым есть данные. За последнее десятилетие увеличилась частота встречаемости случаев инфекции H. pylori, устойчивых к кларитромицину, которые в настоящее время составляют 30% от всех случаев в Японии и Италии, 50% в Китае и 40% в Турции. В то же время частота встречаемости резистентности к кларитромицину намного ниже (примерно 15%) в Швеции и на Тайване. Резистентность к другим антибиотикам также растет, хотя и не столь быстро.
Эффективная антибиотикотерапия основывается на информации о резистентности патогена к антибиотикам. Во многих регионах мира существует необходимость в описании региональной частоты встречаемости резистентности клинических изолятов H. pylori. Остро ощущается потребность в быстрых тестах для определения антибиотикорезистентности. Увеличение частоты эрадикации возбудителя возможно посредством подбора схем лечения. Обоснованный выбор антибиотиков в перспективе может привести к снижению встречаемости антибиотикорезистентности в популяции патогена.
D.G. Ahmetova 1 , A.Zh. Baltabekova 2 , A.V. Shustov 2
2 National Center for Biotechnology, Astana
Prevalence of HP resistance to antibiotics depends on geographical region and according to available data it is growing in many countries. Effectiveness of HP infection treatment is declining in all region due to available data. Last decade is characterised by growth of incidence of HP resistance to clarithromycin, which currently account for 30% of cases in Japan and Italy, 50% in China and 40% in Turkey. At the same time, the incidence of clarithromycin resistance is much lower (about 15%) in Sweden and Taiwan. Resistance to other antibiotics is also growing, though not so fast.
Effective antibiotic therapy is based on data about pathogen resistance to antibiotics. There is a need in describing the regional frequency of antibiotic resistance of clinical isolates of HP in many regions of the world. Rapid test for HP antibiotic resistance assessment is highly anticipated. Increasing of HP eradication frequency is possible through selection of treatment regimens. Reasonable selection of antibiotics in the long term can reduce the prevalence of antimicrobial resistance in pathogen population.
For citation: Ahmetova D.G., Baltabekova A.Zh., Shustov A.V. Antibiotic resistance of Helicobacter pylori: review of epidemiological trends and problems of treatment // RMJ. Medical Review. 2018. № 7(I). P.13 –18.
Европейское многоцентровое исследование, проведенное с 2008 по 2009 г., показало частоту встречаемости резистентности случаев инфекции H. pylori к кларитромицину, метронидазолу и левофлоксацину: 17,5%, 34,9% и 14,1% соответственно [5]. Исследование, выполненное в Японии в 2002–2005 гг., выявило быстрый рост случаев инфекции, вызванных кларитромицин-устойчивым штаммом H. pylori; уровень резистентности к кларитромицину увеличился с 18,9 до 27,7% за указанный 3-летний период. Резистентность к метронидазолу в этот период оставалась на одном уровне (3,3–5,3%), а устойчивость к амоксициллину практически не встречалась. В исследовании консорциума SHARP (Surveillance of H. pylori Antimicrobial Resistance Partnership) выполнен метаанализ данных, собранных с 1993 по 1999 г., и показано, что уровень резистентности к кларитромицину, метронидазолу и амоксициллину составил 10,1, 36,9 и 1,4% соответственно. Проспективное многоцентровое исследование HARP (Helicobacter pylori Antimicrobial Resistance Monitoring Program) проводилось в период 1998–2002 гг. и продемонстрировало резистентность к кларитромицину, метронидазолу и амоксициллину в 12,9, 25,1 и 0,9% случаев соответственно.
Существует веские данные в пользу того, что встречаемость резистентных штаммов положительно коррелирует с объемом потребления антибиотиков в общей популяции [5]. В работе, посвященной исследованию эпидемиологии инфекции H. pylori у коренного населения Аляски, показано, что применение макролидов в анамнезе было статистически связано с повышенной частотой встречаемости резистентности H. pylori к кларитромицину. В обследованной группе 37% были заражены кларитромицин-резистентными H. pylori, и из этих пациентов 92% ранее получали лечение макролидами. Более того, наблюдался эффект зависимости от дозы: частота встречаемости резистентности к кларитромицину была тем выше, чем большее количество курсов лечения макролидами было в подгруппах обследованных. В этой популяции подобная связь была найдена между частотой резистентности к метронидазолу и объемом использования метронидазола в индивидуальной истории больных [17].
к кларитромицину. Например, распространенность устойчивости к кларитромицину значительно возросла (с 1,8% в 1996 г. до 27,1% в 2008 г.) в Японии; серопозитивность за период 2000–2013 гг. выросла с 40 до 55%, а встречаемость кларитромицин-резистентных случаев достигла 31,1%. Аналогично в Китае с 2000 по 2014 г. встречаемость резистентности H. pylori к кларитромицину выросла более чем в 3 раза (!) — с 14,8 до 52,6%; одновременно росла серопозитивность в общей популяции — с 65 до 83% [8, 9, 19]. В Корее встречаемость кларитромицин-резистентных случаев в период с 2005 по 2009 г. выросла еще больше — с 11 до 60%. У населения США в общей популяции распространенность устойчивости к кларитромицину возросла с 6,1% в 1993 г. до 12,9% в 2002 г. [15], в педиатрической популяции распространенность резистентности к кларитромицину значительно выше, чем в общей популяции, и достигает 50% [24]. 
2) пациенты, получавшие антибиотики из группы макролидов в течение одного года, предшествовавшего данному исследованию;
3) пациенты, участвующие в любых других клинических исследованиях;
4) пациенты, получавшие ингибиторы протонного насоса и препараты висмута в течение двух недель, предшествовавших данному исследованию;
5) больные, принимающие антибактериальную терапию на момент забора материала.
2) пациенты с инфекцией H. pylori, подтвержденной быстрым уреазным тестом гастробиоптата, полученного при проведении эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС);
3) решение врача в рамках рутинной клинической практики и диагноза пациента провести ЭГДС с забором биоптата.
Среды и растворы антибактериальных препаратов готовили непосредственно перед использованием.
На чашки Петри с ростом H. pylori добавляли по 1–2 мл стерильного физиологического раствора и снимали бактериальную массу. Инокулюм наносили бактериологической петлей на поверхность чашки Петри с селективной кровяной средой с определенной концентрацией антибиотика, равномерно распределяя по поверхности. Затем чашки Петри помещали в анаэростат и инкубировали при температуре 37 °С в течение 3–5 суток. После окончания инкубации отмечали чашку с концентрацией антибактериального препарата, вызывающей полное подавление роста микробов. Контроль чистоты роста культуры оценивали по посеву на чашку Петри с селективной кровяной средой без добавления антибиотиков.
Данный метод позволил подразделить штаммы H. pylori на чувствительные и устойчивые [9]. Критерии распределения штаммов по степени чувствительности приведены в табл. 1.
На каждого пациента, гастробиоптат которого использовался в исследовании, заполнялась индивидуальная регистрационная карта (ИРК), которая дублировалась в базе данных Microsoft Access Database и содержала демографические, анамнестические данные, результаты проведенных исследований.
Статистический анализ выполнялся с помощью программного пакета IBM® SPSS® Statistics, версия 21.0.
Демографические и анамнестические показатели анализировались с помощью методов описательной статистики. Для дихотомических показателей резистентности были представлены 95% доверительные интервалы для долей резистентности к тому или иному антибиотику. Подобный статистический анализ проводился в отношении выявления наличия H. pylori и выявления резистентности к антибиотикам.
В исследовании использовались гастробиоптаты 109 пациентов в возрасте от 18 до 64 лет. Возраст, пол и диагноз пациентов представлены в табл. 2.
У пациентов были диагностированы различные заболевания, ассоциированные с H. pylori. Наиболее частой нозологией являлся хронический гастрит — 78,9% (n = 86). Язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки (ДПК) диагностирована у 20,2% (n = 22), а язвенная болезнь желудка — у 0,9% (n = 1).
Инфицирование H. pylori было подтверждено у всех пациентов уреазным тестом. Бактериологическим методом микроорганизм выделен лишь у 56 пациентов, что составило 51,4% (95% ДИ: 42,0%, 60,8%). Такой процент отражает технические трудности, связанные с транспортировкой и культивированием микроаэрофильного микроорганизма.
Чувствительность H. pylori к антимикробным препаратам удалось определить у 48 выделенных штаммов. Из-за скудного роста культуры в 8 случаях оценить антибиотикограмму было невозможно.
Таким образом, в анализ резистентности были включены 48 штаммов хеликобактера, выделенных от 48 пациентов. Среди анализируемых изолятов H. pylori штаммов, 17 (42,5%) были резистентны к метронидазолу, 13 (27,1%) — к левофлоксацину, 12 (25%) — к кларитромицину. Кроме того, было выявлено 3 (6,3%) штамма, устойчивых к амоксициллину. Все тестируемые штаммы были чувствительны к тетрациклину. В случаях выявления резистентности к трем и более группам антимикробных препаратов, штамм хеликобактера относили к полирезистентным. В ходе исследования 5 (11,1%) микроорганизмов были полирезистентными (табл. 3).
Двойная резистентность к кларитромицину и метронидазолу обнаружена у 2 (4,4%) изолятов, метронидазолу и левофлоксацину — у 4 (8,3%) микроорганизмов. Все штаммы, резистентные к амоксициллину, были устойчивы к кларитромицину.
Частота встречаемости резистентных штаммов отличалась среди мужчин и женщин, однако данный факт сложно интерпретировать из-за малой выборки (табл. 4).
При анализе частоты резистентности к кларитромицину выявлены различия по нозологиям. Так, у 14 пациентов, страдающих язвенной болезнью, было 5 (35,7%) случаев выделения штаммов H. pylori, резистентных к кларитромицину. В то же время у 34 больных, у которых был диагностирован только хронический гастрит, частота выделения резистентных штаммов к кларитромицину была ниже — 7 (20,6%). Однако этот факт сложно интерпретировать из-за ограниченного числа наблюдений.
Согласно Маастрихтским рекомендациям IV пересмотра, уровень резистентности H. pylori к кларитромицину в популяции является определяющим фактором при выборе схемы эрадикации [10]. Подобно другим патогенам, хеликобактер имеет региональные особенности резистентности. Резистентность напрямую коррелирует с частотой назначения антимикробных препаратов и утвержденными протоколами выбора антибиотиков [11]. Невозможно экстраполировать данные о резистентности, выявленные в одной стране, на другую, в силу значительных региональных различий чувствительности микроорганизмов. Так, резистентность к кларитромицину в Нидерландах составляет всего 5,6%, тогда как резистентность H. pylori к данному антибиотику в Австрии достигает 35,4% [11]. Уровень устойчивости к метронидазолу в Пекине составил 63,9%, а на Юго-Восточном побережье Китая — 95,4% [16, 17]. Для анализа антибиотикорезистентности H. pylori в мире нами были отобраны наиболее масштабные исследования, проводимые с 2000 по 2013 год. Проанализировано 13 исследований, из которых 3 европейских, 5 азиатских, 2 африканских и 3 американских. Более подробно уровень резистентности к антибиотикам H. pylori в различных странах приведен в табл. 5.
При анализе результатов исследований по антибиотикорезистентности H. pylori на территории России обращает на себя внимание рост уровня резистентности H. pylori к кларитромицину. Так, в 1996 г. в г. Москве не было выявлено резистентных штаммов к кларитромицину. Уже в 1999 г. уровень резистентности H. pylori к кларитромицину составил 17,1%, в 2000 г. 16,6%, в 2001 г. 13,8%, а в 2005 г. уже 19,3% [24, 25]. При интерпретации показателей резистентности важно учитывать методику определения чувствительности. Так, при использовании только генотипического метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) возможны сложности в интерпретации результатов. Примером могут служить данные, полученные в Санкт-Петербурге — 39–40% резистентных штаммов по данным ПЦР [26, 27]. В то же время резистентность к кларитромицину при оценке дискодиффузионным методом, который тоже имеет определенные ограничения, составила всего 7,7% [28].
Наибольшую информативность представляют данные о резистентности, полученные методом серийных разведений. На основании тестирования 133 штаммов методом серийных разведений сделан вывод о низкой резистентности в Смоленске в 2010 г. [29]. В нашем исследовании, при использовании сходной технологии тестирования, резистентность составила 25%, что еще раз иллюстрирует межрегиональные различия чувствительности микроорганизмов.
Фенотипический метод определения чувствительности к антибиотикам рекомендован Институтом по клиническим и лабораторным стандартам (CLSI), EUCAST, а также Маастрихтским соглашением IV пересмотра в качестве основного метода определения чувствительности H. pylori к кларитромицину [38]. Культуральный метод является высокоспецифичным тестом, однако характеризуется низкой чувствительностью [39]. Определение чувствительности H. pylori к антибиотикам в нашей стране сопряжено с рядом трудностей. Успех бактериологического выделения H. pylori во многом связан с правильностью отбора биопсийных образцов и соблюдением условий транспортировки материала в лабораторию. Хеликобактер является труднокультивируемым микроорганизмом, что требует не только навыков работы с его чистой культурой, но и четкого соблюдения методики разведения рабочих концентраций исследуемых антибактериальных препаратов. Учитывая объективные сложности, описанные выше, становится понятным отсутствие широко представленных данных об истинном состоянии антибиотикорезистентности в различных регионах нашей страны. Большинство исследователей в своих суждениях об антибиотикорезистентности H. pylori опираются на метод ПЦР как единственную доступную альтернативу бактериологическому методу, который позволяет определить генетические мутации H. pylori и прогнозировать фенотипическую резистентность [7].
Такая стратегия была использована нами для лечения пациентов, гастробиоптаты которых использовались в данном исследовании. Применение стандартной тройной терапии с двойной дозой ингибиторов протонного насоса, усиленной препаратом висмута трикалия дицитрата, привело к уничтожению H. pylori у 93,2% пациентов, несмотря на выявленную высокую резистентность к кларитромицину [44].
На основании проведенного бактериологического исследования антибиотикорезистентности штаммов H. pylori можно сделать следующие выводы и рекомендации:
Полученные данные о резистентности H. pylori в Санкт-Петербурге делают актуальным использование всех возможностей для повышения эффективности стандартного подхода: двойные дозы ингибиторов протонного насоса, увеличение длительности с 7 до 10–14 дней, добавление препаратов висмута и пробиотиков, поиск новых стратегий эрадикации.
Литература
За остальным списком литературы ? обращайтесь в редакцию.
В. И. Симаненков* , 1 , доктор медицинских наук, профессор
Н. В. Захарова*, доктор медицинских наук, профессор
А. Б. Жебрун**, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН
А. В. Сварваль**, кандидат медицинских наук
И. В. Савилова*
Р. С. Ферман**
* ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И. И. Мечникова, Санкт-Петербург
** НИИ ЭиМ им. Пастера, Санкт-Петербург
Читайте также: